CdSe@ZnS量子点标记抗体探针的纯化和在肿瘤标志物检测中的应用

发布时间：2018-03-01 03:08

  本文关键词： CdSe@ZnS量子点 纳米材料 荧光 纯化 肿瘤标志物 高效尺寸排阻色谱法 靶向成像 生物探针　出处：《武汉大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：量子点是具有优异光学性能的无机半导体纳米晶,具有荧光量子产率高、激发光谱宽、发射光谱窄、光稳定性好等优点。量子点已广泛应用于传感、标记、成像和示踪等生物医学领域。过去的二十年文献报道中,量子点主要由化学合成和生物合成策略得到。然而,迄今为止,高质量的CdSe@ZnS量子点是在有机相中通过化学合成法获得,而疏水CdSe@ZnS量子点首先需要进行水溶性化修饰和生物功能化,然后才能用于生物医学领域。量子点的水溶性化修饰主要有疏水包覆和配体交换两种策略,用两亲性聚合物分子通过疏水包覆的方法可较好地保持量子点的荧光性能,所以本文选用此法。无论是其表面修饰或随后的生物功能化过程,都要引入一些过量的修饰分子,在这些杂质中,量子点生物探针的一些胶体杂质会影响其性能,又难于用简单的纯化方法除尽,所以对亲水性量子点和量子点标记抗体探针进行纯化是保证量子点能够提供可靠成像信息的先决条件。在目前文献报道的量子点纯化方法中,高效尺寸排阻色谱是很有效的分离纯化方法。本文通过优化高效尺寸排阻色谱实验条件,得到比文献报道的单分散CdSe@ZnS量子点标记抗体探针和胶体杂质之间更高的分离度,除去了亲水CdSe@ZnS量子点和量子点标记抗体探针中的主要胶体杂质。经色谱纯化的亲水性量子点和量子点标记抗体探针在应用中更具有优势。在构建量子点荧光探针过程中,纯化是减少产品中杂质的关键步骤。包括高效尺寸排阻色谱法、超速离心法、超滤法、透析法等都曾被用于量子点的纯化。与其他依靠溶质和固定相的相互作用实现分离的色谱方法不同,高效尺寸排阻色谱法是根据样品尺寸大小进行分离的,属于“分子筛效应”,样品与固定相之间无特异性相互作用,所以高效尺寸排阻色谱法具有操作条件温和、回收率高、能最大程度上保持生物分子活性的优势。由于上述优点,高效尺寸排阻色谱法已广泛用于蛋白质、聚合物等大分子物质以及纳米材料等的分离。因此,本论文将高效尺寸排阻色谱法用于亲水性CdSe@ZnS量子点以及量子点标记抗体荧光探针的纯化。首先,我们将疏水CdSe@ZnS量子点用辛胺接枝的聚丙烯酸进行修饰,团聚的聚丙烯酸修饰的量子点和多余的修饰材料用高效尺寸排阻色谱法除去,得到单分散的表面羧基的CdSe@ZnS量子点。然后对单分散的表面羧基量子点进行聚乙二醇修饰,再将表面带有胺基的聚乙二醇修饰的量子点与链霉亲和素(streptavidin, SA)或抗体(Immunoglobulin G, IgG)进行共价偶联,得到QD-SA或QD-IgG偶联复合物。因为未参加反应的生物分子和量子点的悬浮团聚物也混入量子点与蛋白的偶联复合物中,而且量子点的悬浮团聚物与单分散的量子点标记抗体探针性质差别小,不容易采用简单的纯化方法分开,量子点的悬浮团聚物对单分散的量子点生物探针的胶体稳定性具有破坏作用,而且在对切片上肿瘤标志物检测的实验中会带来非特异性吸附,所以必须将量子点标记抗体探针中的悬浮团聚物除去。由于量子点与蛋白的复合物与修饰量子点的蛋白之间性质差异小而难于完全将两者分离,所以制备单分散的量子点生物荧光探针仍然是个难题。我们采用高效尺寸排阻色谱法除去了量子点悬浮团聚物、多余未反应的链霉亲和素或抗体分子,得到单分散的量子点荧光探针用于乳腺癌肿瘤组织切片上肿瘤标志物的检测。这些结果显示经高效尺寸排阻色谱法纯化得到的量子点荧光探针特异性更强。CdSe@ZnS量子点是一种量子点的“老成员”,因此适合将其用做构建一个高效尺寸排阻色谱法为基础的纯化方法的模型。经过在色谱流动相中加入适当浓度的氯化钠,降低流速,多根色谱柱串起来以增加柱长等色谱条件的优化,加上高效尺寸排阻色谱法有重复性好、回收率高的优势,实现了胶体杂质和单分散的亲水性量子点和量子点标记抗体探针的制备。该方法有望作为一种标准的纯化方法推广到其他种类的纳米材料的分离纯化中。本论文尝试用高效尺寸排阻色谱法纯化亲水性CdSe@ZnS量子点以及CdSe@ZnS量子点生物探针,具体内容如下：1.用辛胺接枝的聚丙烯酸对量子点进行水溶性化修饰,用高效尺寸排阻色谱法除去多余的修饰材料OPA和量子点的悬浮团聚物,纯化得到的单分散的表面羧基的量子点至少在一年内保持了良好的胶体稳定性。表面羧基的CdSe@ZnS量子点和两端胺基的聚乙二醇进行偶联,得到表面胺基的聚乙二醇修饰的量子点。2.表面胺基的聚乙二醇修饰的量子点分别与SA或与二抗IgG进行偶联,分别形成QD-SA与QD-IgG。未反应的生物功能修饰分子和量子点的悬浮团聚物被从新制备的偶联复合物中除去,得到单分散的QD-SA或QD-IgG。将单分散的探针用于检测乳腺癌肿瘤组织切片上的肿瘤标志物高分子量细胞角蛋白(high molecular weight cytokeratin, CK34βE12)、E-钙粘附蛋白(E-cadherine, E-cad)和p120连环蛋白(p120 catenin, p120)。纯化得到的量子点荧光探针显示了特异性的阳性信号而无非特异性信号。因此,结合高效尺寸排阻色谱法在内的一系列纯化操作,是有效的、具有普适性的纯化方法,用于收集得到单分散的量子点荧光探针,这对生物医学应用是非常重要的。肿瘤标志物分子的检测结果与传统的免疫组化法结果一致。3.用表面胺基的聚乙二醇修饰的量子点与巯基化修饰的抗HER2的小鼠抗人抗体进行偶联,并将此偶联复合物用高效尺寸排阻色谱法进行纯化,未偶联的抗体和量子点悬浮团聚物从新制备的偶联复合物中除去,得到单分散的量子点和HER2抗体的复合物(QD-HER2-Ab),并将其用做体内瘤体靶向成像的荧光探针。将纯化的QD-HER2-Ab探针按相对裸鼠体重15 nmol·kg-1的剂量经尾静脉注射到裸鼠体内,对养7天之后的裸鼠进行观察,未发现明显的急性中毒症状,而且显示了QD-HER2-Ab探针在瘤体靶向特异性的成像能力。在乳腺癌异种种植的肿瘤动物模型中(注射后24小时),注射经高效尺寸排阻色谱法纯化的QD-HER2-Ab探针和未纯化探针的荷瘤裸鼠的肝脏中,残余镉的浓度分别为8.3 ng·kg-1和56.7 ng·kg-1。高效尺寸排阻色谱法纯化后的QD-HER2-Ab探针未导致注射组裸鼠主要内脏器官的炎性症状,评价肝、肾功能的几项血液生化指标也都在正常的水平。由于注射了色谱法纯化得到的QD-HER2-Ab的裸鼠外周血和肝脏中残余的量子点浓度降低,成像背景降低,所以其瘤体靶向成像的特异性增加。高效尺寸排阻色谱法纯化后的QD-HER2-Ab探针提供了一种精准的乳腺癌瘤体靶向成像和HER2体内、体外检测的纳米荧光材料,同时也为其他类型量子点探针的纯化提供借鉴。随后我们制备了量子点和抗甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)抗体的偶联复合物(QD-AFP-Ab),并按上述方法纯化,经高效尺寸排阻色谱法纯化得到的QD-AFP-Ab用于异种种植的肝癌皮下瘤动物模型的瘤体靶向成像,LM9细胞作为成瘤的细胞。用高效尺寸排阻色谱法纯化得到的QD-AFP-Ab探针能特异性地实现对荷肝癌皮下瘤裸鼠活体中的瘤体靶向成像。总之,本论文以高效尺寸排阻色谱法为关键技术,重点研究了亲水性CdSe@ZnS量子点与CdSe@ZnS量子点标记抗体探针的纯化方法,原位靶向成像结果表明：纯化之后的单分散的量子点标记抗体探针探针在体外、体内肿瘤标志物检测中具有明显优势。
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【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O657;R730.43
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本文编号：1550118