MicroRNA-30a-5p对肝癌细胞增殖凋亡及侵袭转移的实验研究
本文关键词： 肝细胞肝癌 微小RNA 增殖 凋亡 侵袭 转移 出处：《重庆医科大学》2015年硕士论文 论文类型：学位论文
【摘要】：背景与目的肝细胞肝癌(hepataocellular carcinoma, HCC)是最常见的消化系统恶性肿瘤之一,具有发病率高、预后差、侵袭性强等特点。深入研究肝癌发生发展的分子机制,试图为肝癌的诊治提供新的思路。MicroRNA(miRNA)是一类大小约为19-25bp的非编码单链小分子RNA,在不破坏mRNA稳定性的前提下通过与靶标基因mRNA 3'UTR完全或不完全互补配对,进而抑制或阻断靶基因翻译。miRNA具有高度时序性、保守性、组织特异性的特点,单一miRNA可调控多个靶基因,同时也可能一个靶基因受到多个miRNA的调控。通过大量肝癌组织与正常肝组织miRNA表达谱的比较发现,其中有一部分]miRNA表达上调,有一部分表达下调,上调的miRNA可能起着促癌基因的作用,而表达下调的miRNA则可能起着抑癌基因的作用。筛查肝癌患者的miRNA谱,发现与正常肝组织对比,miRNA-30b、-30c、-30e等表达明显下调,特别是在已经发生转移的肝癌组织中,下调更甚,这提示miRNA-30家族表达下调与肝癌的形成可能有一定的联系。目前miRNA-30家族成员在肝癌中的具体作用机制研究较少。其中,家族成员之一miRNA-30a-5p在其他肿瘤中常见报道,因此我们挑选miRNA-30a-5p为研究对象,检测其对肝癌细胞SMCC-7721增殖、凋亡、侵袭转移能力的影响。方法1.采用RT-qPCR检测miRNA-30a-5p在肝癌组织中与正常肝组织中的表达差异：2.采用RT-qPCR检测miRNA-30a-5p在肝癌细胞株中与正常肝细胞株中的表达差异；3.采用转染技术过表达肝癌细胞株内miRNA-30a-5p的表达水平；4.采用CCK-8、流式细胞术、Transwell迁移侵袭实验对miRNA-30a-5p进行体外功能分析,观察过表达miRNA-30a-5p后肝癌细胞株的生物学行为变化；5.采用裸鼠成瘤实验对miRNA-30a-5p进行体内功能分析,观察过表达miRNA-30a-5p后肝癌细胞对裸鼠成瘤的影响；6.采用生物学信息技术预测miRNA-30a-5p的靶标基因,Western Blot技术进行初步验证。结果1.通过RT-qPCR分别检测48例手术肝癌组织、相应癌旁组织标本及10例正常肝组织标本中miRNA-30a-5p的表达,发现miRNA-30a-5p在肝癌组织中的相对表达量(0.31367±0.0568)低于癌旁肝组织(0.61226±0.0954)、正常肝组织(1.0733±0.0412),差异具有统计学意义(p0.05),RT-qPCR分别检测7种肝癌细胞株SMCC-7721、Huh7.0、 HepG2、HCCLM3、HCCLM6、MHCC-97H、MHCC-97L及正常肝细胞株L02中miRNA-30a-5p的表达,发现miRNA-30a-5p在7种肝癌细胞株的相对表达量均低于正常肝细胞株,差异有统计学意义(p0.05)；2.通过转染miRNA-30a-5p mimics入肝癌细胞株SMCC-7721细胞,CCK-8实验发现miRNA-30a-5p过表达后可以抑制SMCC-7721细胞的增殖能力(P0.05),流式细胞术显示miRNA-30a-5p过表达促进了细胞凋亡,细胞周期出现了S期阻滞,Transwell迁移侵袭实验表明,miRNA-30a-5p过表达可以抑制SMCC-7721细胞的体外迁移、侵袭能力(p0.05)；3.通过裸鼠成瘤实验,观察到肝癌细胞SMCC-7721在转染miRNA-30-5p后,裸鼠皮下肿瘤的生长明显减缓,与空质粒转染组、空白组相比较,肿瘤的大小、质量减少,差异有统计学意义(P0.05),生物信息学技术预测miRNA-30a-5p的可能靶基因,并利用western blot技术初步验证了DNA甲基化转移酶3A (DNA methltransferase 3A)可能是miRNA-30a-5p的靶基因。结论miRNA-30a-5p可抑制肝癌细胞增殖、促进其凋亡,减弱其转移、侵袭能力。
[Abstract]:Background and objective: hepatocellular carcinoma (hepataocellular, carcinoma, HCC) is one of the most common malignant tumor of the digestive system with high incidence rate, poor prognosis and aggressive characteristics. Research on the molecular mechanism of HCC development, trying to provide new ideas for the diagnosis and treatment of liver cancer.MicroRNA (miRNA) is a kind of size non encoding small single stranded RNA 19-25bp, without destroying the stability of mRNA by 3'UTR and the target gene mRNA complete or incomplete complementary, thereby inhibiting or blocking the translation of target genes.MiRNA sequence is highly conservative, and characteristics of tissue specificity, a single miRNA can regulate the expression of multiple target genes, but also may be a a target gene regulated by multiple miRNA. The spectrum comparison found through a large number of liver tissue and normal liver tissue miRNA expression, which is a part of]miRNA expression, a part of expression, Upregulation of miRNA may play a role in promoting cancer gene, and expression of miRNA may play a role of tumor suppressor genes. Screening in patients with hepatocellular carcinoma miRNA spectrum, compared with normal liver tissue, miRNA-30b, -30c, -30e gene expression was significantly decreased, especially in has occurred in metastatic HCC tissues, decreased so, suggesting that miRNA-30 family expression and hepatocellular carcinoma form a contact. Currently a member of the miRNA-30 family in hepatocellular carcinoma specific mechanism research. Among them, one of the family members of miRNA-30a-5p in other cancers commonly reported, so we choose miRNA-30a-5p as the research object, to detect the apoptosis of hepatoma cell SMCC-7721 proliferation, influence the invasion and metastasis. Methods 1. RT-qPCR was used to detect the different expression of miRNA-30a-5p in hepatocellular carcinoma tissues and normal liver tissues: 2. detected by RT-qPCR miRNA-30a-5p in hepatocellular carcinoma Cell lines and normal liver cell lines differentially expressed by 3.; transfection expression level in hepatocellular carcinoma cell line miRNA-30a-5p; 4. by CCK-8, flow cytometry, Transwell on the migration of miRNA-30a-5p in vitro functional analysis of invasion experiment, observed the changes of the biological behavior of hepatocellular carcinoma cell line miRNA-30a-5p in nude mice by 5. after expression; the miRNA-30a-5p function in vivo analysis of tumor experiment, observed after overexpression of miRNA-30a-5p hepatoma cells of nude mice the effect of the use of information technology; 6. biological predicted targets based on miRNA-30a-5p by Western, Blot technology was preliminarily verified. Results 1. by RT-qPCR were detected in 48 cases of liver cancer tissue, the expression of miRNA-30a-5p in adjacent tissues and 10 cases of normal liver tissues, found that the relative expression of miRNA-30a-5p in hepatocellular carcinoma tissues (0.31367 + 0.0568) below Liver cancer (0.61226 + 0.0954) and normal liver tissues (1.0733 + 0.0412), the difference was statistically significant (P0.05, RT-qPCR) were detected in 7 HCC cell lines SMCC-7721, Huh7.0, HepG2, HCCLM3, HCCLM6, MHCC-97H, MHCC-97L and miRNA-30a-5p expression in normal liver cell line L02, found that the relative expression of miRNA-30a-5p in 7 kinds of HCC cell lines is lower than the normal liver cell line, the difference was statistically significant (P0.05); 2. by transfection of miRNA-30a-5p mimics into SMCC-7721 cells of hepatocellular carcinoma cell line CCK-8, we found that miRNA-30a-5p overexpression could inhibit the proliferation of SMCC-7721 cells (P0.05), showed that overexpression of miRNA-30a-5p promotes cell apoptosis by flow cytometry surgery, cell cycle arrest in the S phase, Transwell showed that the migration and invasion experiments, overexpression of miRNA-30a-5p in vitro can inhibit SMCC-7721 cell migration, invasion (P0.05); 3. by naked Mouse xenograft experiments, observed in SMCC-7721 cells after transfection of miRNA-30-5p, tumor growth slowed down significantly, and empty plasmid transfection group, blank group compared with the tumor size, quality is reduced, the difference was statistically significant (P0.05), may be the target gene bioinformatics prediction miRNA-30a-5p, and using Western blot preliminary validation of the DNA methyltransferase 3A (DNA methltransferase 3A) may be the target gene of miRNA-30a-5p. Conclusion: miRNA-30a-5p can inhibit cell proliferation, promote apoptosis, decrease the metastasis, invasion.
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7
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，本文编号：1553828
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