N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-V通过改变上皮生长因子受体的糖基化水平增加爱必妥在鼻咽癌细胞中的放疗敏感性

发布时间：2018-03-01 22:22

  本文关键词： GnT-V C225 放疗敏感性 EGFR β1-6糖链　出处：《南方医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景鼻咽癌在中国南方地区有着较高的发病率,严重影响当地人民的生活质量。放射治疗是鼻咽癌的主要治疗方式。爱必妥(Cetuximab,C225)是针对表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)的一种单克隆抗体,在鼻咽癌病人治疗中,可以作为放疗的增敏剂。糖基转移酶N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-V(GnT-V)能催化N-糖链的β1,6分支形成。GnT-V及其产物β1,6糖链分支参与了多种肿瘤的侵袭和转移。本课题组前期实验证实:下调GnT-V的表达能增加鼻咽癌细胞对放疗的敏感性。另有文献证实:GnT-V可通过改变细胞膜表面受体上的β 1,6-糖链,影响信号活化传导而导致化疗耐药或放疗抵抗。由于GnT-V及其糖基化产物β 1,6-糖链能影响鼻咽癌的放疗敏感性;细胞膜表面受体上N-糖链的改变能影响放疗抵抗;且C225是针对EGFR的单克隆抗体,因此我们猜想:GnT-V可能通过调节EGFR上的糖基化水平,从而影响C225对鼻咽癌细胞的放疗敏感性。研究目的探讨GnT-V是否通过调节EGFR的N-糖链β-1,6分支结构影响C225的放疗增敏作用,通过本项目研究,进一步丰富C225放疗增敏作用的分子机制。研究方法1.慢病毒转染鼻咽癌细胞株CNE1和CNE2,干扰GnT-V表达。2.RNA提取及RT-PCR测mRNA表达。3.免疫印迹Western blot检测蛋白质表达4.凝集素实验用PHA-L检测总β1-6糖链表达。5.细胞功能学实验检测肿瘤细胞恶性行为学。6.裸鼠皮下成瘤实验及分割放射治疗。7.免疫组化用PHA-L测裸鼠皮下肿瘤β1-6糖链水平。8.统计学分析。结果1.构建稳定低表达GnT-V的鼻咽癌细胞株及检测干扰效果用慢病毒为载体的shRNA干扰鼻咽癌细胞CNE1,CNE2中GnT-V的表达,建立稳定低表达GnT-V细胞株。2.GnT-V联合C225对鼻咽癌细胞放疗的影响(1)测量鼻咽癌细胞中C225的半抑制浓度(IC50)CNE1和CNE2细胞中,测得C225的IC50值分别为:717μg/ml和1244μg/ml。有文献指出:当药物在细胞实验中作为放疗增敏剂时,其实际应用浓度应为IC50值的五分之一[1]。因此在本实验中,C225作为鼻咽癌细胞放疗增敏剂的实验浓度分别为:143μg/ml和249μg/ml。无射线条件下,五分之一的IC50值浓度的C225,对CNE1与CNE2两组细胞的增殖活性无影响。(2)下调GnT-V联合C225能增加鼻咽癌细胞对放疗的敏感性两株鼻咽癌细胞各分为“放射组”、“下调+放射组”、“C225+放射组”、“下调+C225+放射组”。由克隆形成实验、迁移划痕实验、增殖活性实验及流式细胞实验证实:“放射组”的克隆形成率、细胞存活率和迁移划痕率最高,凋亡率最低;“下调+C225+放射组”克隆形成率、细胞存活率和迁移划痕率最低,凋亡率最高。3.探讨下调GnT-V增加C225的放疗敏感性与EGFR上β1-6糖链的关系。(1)用苦马豆碱(SW)抑制高表达GnT-V的CNE2细胞株上的β1-6糖链,随后将细胞分为“放射组”,“放射+SW组”“放射+SW+C225组”。由克隆形成实验、迁移划痕实验、增殖活性实验证实:克隆形成能力、迁移能力以及细胞活力由高至低分别是:“放射组”,“放射+SW组”“放射+SW+C225组”。因此,β1-6糖链与C225的放疗增敏相关。(2)CNE1,CNE2两株细胞的各个实验组中,EGFR的mRNA、蛋白水平均无统计学差异。但用凝集素实验检测各实验组中β1-6糖链的水平发现:“放射组”糖链水平最高,“放射+下调+C225组”水平最低。随后用免疫沉淀方法验证EGFR上的β1-6糖链,亦发现:“放射组”中EGFR的β1-6糖链水平最高;“放射+下调+C225组”中EGFR的β1-6糖链水平最低。因此,GnT-V影响C225的放射增敏机制可能是由于改变了 EGFR上的β1-6糖链。4.下调GnT-V联合C225在放疗条件下对裸鼠成瘤的影响(1)裸鼠肿瘤生长速度,“放射组”的最快,“下调+C225+放射组”最慢。(2)免疫组化实验用PHA-L测量裸鼠皮下肿瘤的β1,6糖链表达水平。发现实验组中生长速度快的肿瘤中β1,6糖链的含量更高。5.GnT-V影响C225放疗敏感性的可能信号通路探究EGFR下游PI3K/AKT通路发现,各实验组磷酸化PI3K和磷酸化AKT的水平不同。实验结果发现,对射线更敏感的细胞,p-PI3K及p-AKT水平更低。结论1.靶向GnT-V的shRNA真核表达慢病毒可以显著下调GnT-V的mRNA和蛋白表达。2.下调GnT-V能进一步增加C225的放疗增敏效果。3.GnT-V影响C225的放疗敏感性可能是通过改变EGFR上的β 1-6糖链。4.下调GnT-V联合C225在放疗条件下能减慢裸鼠肿瘤生长。5.GnT-V联合C225影响放疗敏感性可可与PI3K/AKT通路相关。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R739.63
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本文编号：1553853