MicroRNA-206影响结直肠癌增殖与转移的机制研究

发布时间：2018-03-03 18:36

  本文选题：结直肠癌　切入点：miR-206　出处：《南京医科大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景和目的：众所周知,基因突变、表型漂移、上皮间质转化(EMT)、集体迁移、抑制细胞凋亡及失巢凋亡、血管和淋巴管转移是当前肿瘤的转移机制。研究表明,microRNAs主要是通过调节基因表达进而影响肿瘤发展,从而在致癌机制中发挥着重要作用,如抑制癌细胞的增殖和迁移、阻断细胞周期、激活细胞凋亡。当某一特定的miRNA证实参与肿瘤转移过程,那么沉默该项癌基因或上调肿瘤的抑癌基因可作为肿瘤的潜在治疗策略.microRNA.206(miR-206),是MyomiRs家族成员之一,在人类许多恶性肿瘤(包括结直肠癌)中的表达下调,并且与更多的恶性表型相关联,在恶性肿瘤的发生和进展中起着重要的作用。结直肠癌(Colorectal cancer CRC)是全球范围内最常见的肿瘤之一,肿瘤转移及病情进展是导致CRC患者死亡的主要原因。因此,在结直肠癌中进一步研究miR-206的调控机制具有重要意义。近来研究显示,在HeLa细胞和C2C12细胞中miR-206经由靶向调控NOTCH3通路发挥抑制作用。目前,在CRC中miR-206是否能够靶向调控NOTCH3的研究未有报道。因此,在CRC中,我们试图探讨miR-206及其目标NOTCH3对肿瘤抑制和转移的影响。资料和方法：采用49例接受手术治疗的结直肠癌的患者(Ⅰ期及Ⅱ期归为非转移性疾病n =28:III期和Ⅳ期转移性疾病n=21)的肿瘤组织和正常组织的切片标本,用免疫组化方法检测NOTCH3及原位杂交法检测miR-206在组织中的分布。在肿瘤组织和正常组织中,使用RT-PCR方法定量miR-206的表达水平(RNU6-1作为内参),Westemblot检测NOTCH3蛋白表达(ACTB作为内参)。培养结肠癌细胞(SW480)和转移瘤株(SW620)进行后续一系列实验。通过miR-206mimic转染SW480. SW620细胞后,检测NOTCH3 mRNA及蛋白表达。在细胞转染后,分别用MTT法检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡以及Western blotting法检测caspase-3的蛋白表达。流式细胞仪测定细胞周期分布和GO/G1、S、G2/M期细胞的比例。要确定是否miR-206影响CRC细胞迁移,采用两种方法(划痕试验和Boyden小室检测)进行细胞迁移实验。此外,miR-206转染SW480、SW620细胞后,检测NOTCH3转录靶基因(JAG1和HEY1)和转移相关基因(CDH2和MMP9) mRNA的表达水平。结果：结直肠癌中,Ⅰ-Ⅱ期患者或III-IV期的肿瘤组织和正常组织之间的miR-206表达有显著差异,肿瘤组织中miR-206表达水平明显下调。与此相反,NOTCH3蛋白在肿瘤组织中明显上调,而在正常组织中仅有最小检测。原位杂交技术显示,miR-206在正常粘膜中呈弱表达,但在肿瘤组织却没有表达。免疫组化实验中,NOTCH3主要定位在细胞质和细胞核的肿瘤细胞,并且具有很强的染色,而在正常黏膜很少可见。在用miR-206mimic转染结肠癌细胞SW480和转移细胞株SW620后,相比对照组,NOTCH3mRNA和蛋白水平均中均显著降低。MTT检测miR-206 mimic转染后细胞活力显著降低。细胞周期表明,G0/G1期细胞比例明显升高而在S期和G2/M期细胞比例明显减少。miR-206 mimic转染的细胞导致凋亡数量增加以及caspase-3的含量上调。miR-206 mimic转染细胞中,伤口闭合能力及细胞迁移的能力显著降低。在SW480、SW620细胞中miR-206 mimic转染后,两个NOTCH转录靶基因(JAG1和HEY1)和转移相关基因(CDH2和MMP9) mRNA的表达水平均明显下调。结论：miR-206表达上调抑制CRC肿瘤细胞的增殖和迁移、阻断细胞周期并且激活细胞凋亡。miR-206的肿瘤抑制能力在不同的CRC细胞中有着相似的效果,但具有着不同的转移潜能,并可通过直接抑制NOTCH3信号以及涉及CDH2和MMP9其他信号转导通路间接作用来发挥作用。研究结果表明,miR-206作为CRC中一种肿瘤抑制基因,可作为临床治疗的一个潜在靶点。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.34

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本文编号：1562212