PTEN和CIRP与垂体腺瘤侵袭性的相关性研究

发布时间：2018-03-04 04:36

本文选题：垂体腺瘤　切入点：PTEN基因　出处：《山东大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：垂体腺瘤(pituitary adenoma)是一种常见的颅内肿瘤,约占颅内肿瘤的10%,发病率仅次于脑胶质瘤和脑膜瘤,居颅内肿瘤第三位。侵袭性垂体腺瘤是一种界于良恶性之间的肿瘤,有着侵袭性生长的生物学行为,当其侵入海绵窦累及颈内动脉、颅神经、硬脑膜等结构,即称其为侵袭性垂体腺瘤。侵袭性垂体腺瘤临床进展迅速,发现时肿瘤体积较大,往往伴有卒中、坏死,加以颅底结构较为复杂,又有多种神经和血管穿行,因此手术难度高、手术风险相对较大,同时又由于侵袭性垂体腺瘤生长方式、侵袭海绵窦等部位导致手术显露困难,术后肿瘤残留率高。这些原因导致侵袭性垂体腺瘤的复发率极高,临床疗效较差,其治疗效果一直困扰着临床医生,给患者带来了极大的痛苦。随着分子生物学技术日新月异的发展,对垂体腺瘤发病机制的研究最近也有很大的进展,但是对于垂体腺瘤侵袭性的具体机制依然不十分明确,因此有必要进一步研究垂体腺瘤的侵袭机制,以期寻找治疗侵袭性垂体腺瘤的靶基因,提供新型的侵袭性垂体腺瘤诊断、治疗方案及理论学基础,以减少垂体腺瘤的复发。PTEN (phosphatase and tensin homolog deleted from chromosome 10, PTEN)于1997年被发现,是一种抑癌基因,是第十号染色体上缺失的磷酸酶与张力蛋白同源基因。Hollander等研究显示,它在人类肿瘤的发生发展中起着非常重要的作用,它位于人类染色体的10q23.3,由九个外显子所组成,是一个肿瘤抑制基因,显示双重特异性磷酸酶活性。PTEN能够通过调控多种肿瘤的浸润、转移等方式,对肿瘤细胞的增殖和迁移有抑制作用,PTEN能够稳定并提高肿瘤细胞间的黏附能力,抑制细胞外基质的降解和肿瘤血管生成、并且诱导细胞凋亡的作用,从而抑制肿瘤的侵袭和转移。突变的PTEN基因与人类多种恶性肿瘤的发生和发展有关。PTEN发生缺失和突变在脑胶质瘤的发生发展中起着同样重要的作用,Kato等研究表明,PTEN基因在大多数胶质瘤中都表现出缺损,这在晚期的胶质母细胞瘤中更为明显,能够达到60%-80%之多；在胶质瘤恶性改变的过程中,PTEN表达下调或缺失起着非常重要的作用。Idoate等人发现,PTEN基因杂和性缺失的频率能够随着胶质瘤级别增加而增加。大量研究证实,PTEN基因的突变或缺失与乳腺癌食管癌,前列腺癌的发生与发展有着十分密切的联系,肿瘤的恶性程度越高,PTEN的表达率越低。目前,基因缺失在垂体瘤的发病中的作用及机制的报道不多,抑癌基因发生突变与垂体腺瘤病程中的发生发展过程有一定的关系,因此PTEN的突变很可能与垂体腺瘤的侵袭力存在一定的相关性,但是目前的研究报道较为罕见,有待进一步明确。冷诱导RNA结合蛋白(cold inducible RNA binding protein, CIRP)属于一种新型的RNA结合蛋白,在人类位列于第19染色体p13.3的位点上。人们对第19号染色体进行研究时发现,其中定位的基因超过1500个,是最高的基因密度的染色体,自然杂志于2004年发表了其基因的全序列。在第19号染色体上,有着特殊的特点,不仅G+C的含量较高,而且所有基因的重排率也非常高,并且同样有着很高的复制率,这些特点也能说明它的活跃度很高,在生物体进化过程中有着十分重要的意义。在对遗传疾病进行研究时发现,很多这类基因都参与了其中。人体如果受到了外界的各种环境的污染,甚至受到了辐射污染,对被污染后损伤的DNA进行修复的基因也是位列于第19号染色体上。CIRP基因在人体的多种细胞上以及在大鼠的内脏组织都有表达,如果机体发生了应激,在不同部位上的CIRP基因的表达会出现上调或下调的变化。CIRP一类基因对机体生理活性调节有着非常重要的作用,CIRP基因进行了转录后能够发挥调节作用。研究显示,基因的转录后的调控,对组织细胞的生长、增殖与分化都有着密切的调节作用,这种作用机制对多种基因的表达以及基因所表达的部位是否发生了异常都有着密切的调控作用,并最终对组织细胞发展分化方向进行影响。最近的研究表明,CIRP有着癌基因的特性,Guo X等研究表明CIRP能够引起人抗原R和细胞周期调控蛋白E1出现异常的表达,这些异常的改变与乳腺癌发病密切相关,Zeng发现当CIRP蛋白活性被抑制后能够降低前列腺癌细胞的增殖能力,将CIRP基因沉默后可以促使肿瘤细胞死亡,存活率降低,并且能够令肿瘤细胞在化疗过程中对药物的敏感性提高。并且有研究显示,在不同的细胞系中,如HeLa.TERA2等细胞,CIRP基因的表达会导致这类细胞的生长发生抑制,由此推测,在肿瘤的治疗当中,CIRP也许是一个新的潜在的作用靶点。在肿瘤的发生以及细胞生长过程的转化中,基因翻译水平发生了突变时会对其有着深入的影响,CIRP在目前的研究中,发现它通过与翻译元件发生相互作用,使得mRNA的翻译获得了促进,令特定的蛋白的合成发生了加速,细胞增殖率提高。但目前为止,这些改变的调控机制仍不明确。Wang M等研究表明,CIRP基因与垂体腺瘤复发增殖密切相关,但由于样本量小,CIRP与垂体腺瘤侵袭性的关系是需要进一步研究的相关。目的：PTEN和CIRP表达改变与垂体腺瘤侵袭性的关系,目前研究报道较少。本实验对复发垂体腺瘤、侵袭性垂体腺瘤、非侵袭性垂体腺瘤组织中PTEN和CIRP的表达情况进行研究,分析其相关性。并与临床资料相结合,研究他们在不同组织的表达情况及相关机制。对垂体腺瘤的发生、发展过程中可能存在的分子生物学机制进行探讨,从而为垂体腺瘤的诊断和治疗提供新的实验理论支持。方法1.选择2014年1月到2016年1月间来临沂市人民医院神经外科手术切除的垂体腺瘤新鲜标本60例,其中20例为复发垂体腺瘤。垂体腺瘤新鲜标本通过影像学提示,使用了Hardy-Wilson与Knosp的方法进行分级,将其中的Ⅲ级以上或者是C期以上的垂体肿瘤划分为侵袭性组别,其他则归为非侵袭性组别,每组为20例患者。在研究过程中,所有纳入研究的患者均自愿签署知情同意书。手术过程中所获得的病理标本,分为两部分,一小部分用作原代细胞培养,另外一部分则通过液氮保持,以做后续实验。2.运用转染技术,结合划痕实验、western blo、real-time PCR及免疫组化在大体水平及细胞水平探讨PTEN与CIRP在垂体腺瘤中的作用及相关机制。结果1.非侵袭性垂体腺瘤PTEN无论是在免疫组化、western blot及PCR的检测中均为最高,在侵袭性垂体腺瘤次之,而复发性垂体腺瘤则是最低,它们之间比较有显著的统计学差异。CIRP蛋白表达则是相反。由此推测,PTEN有抑制肿瘤发展的作用,而CIRP则是促进肿瘤的发展。2.转染了PTEN的细胞增殖较其余几组慢,而转染了CIRP组则有显著的细胞增殖情况,两组比较有明显的统计学差异。同时采用了荧光显微镜进行了验证,结果与上述相同。转染了PTEN的细胞侵袭能力较其余几组明显降低,而转染了CIRP组则细胞侵袭力情况明显增强,两组比较有明显的统计学差异。3.基质金属蛋白酶能降解基底膜和细胞外基质的大部分成分,从而促进肿瘤细胞的侵袭能力,本部分研究中探讨了MMP-2与MMP-9在两基因干预后的蛋白表达变化,结果显示MMP-2与MMP-9在PTEN转染组中,与对照组比较有明显的降低,两者有显著的统计学差异；而在CIRP转染组中,与对照组比较有升高趋势,并且MMP-2的蛋白表达升高更为明显,两者有显著的统计学差异。4.用western blot方法检测各干预组的凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-7及caspase-9的表达,从各转染组对GH3细胞干预后检测凋亡相关基因发现,PTEN细胞凋亡最为明显,而CIRP的细胞凋亡情况则是显著低于PTEN组,两者比较有显著的统计学差异。同样方法检测各干预组的p-AKT的表达,从各转染组对GH3细胞干预后检测p-AKT水平时发现,PTEN能够抑制AKT信号通路的活化,而CIRP则是促进AKT信号通路的活化。我们使用P13K抑制剂LY294002对PI3K/AKT信号通路进行阻断后,再采用上述相同方法干预,再次探讨AKT通路的活化情况,结果显示,使用P13K抑制剂后,能够遏制了CIRP转染组的AKT活化作用,而其余各种变化不明显。结论1.在垂体腺瘤中,非侵袭性垂体腺瘤PTEN表达表达最高,侵袭性垂体腺瘤次之,复发垂体腺瘤最低,而CIRP表达则与之相反。由此推测,PTEN有抑制肿瘤发展的作用,而CIRP则与垂体腺瘤侵袭性和复发有关。2. PTEN与CIRP表达平衡破坏,促使垂体腺瘤侵袭力增加。3. PTEN与CIRP表达平衡破坏,通过调控PI3K/AKT信号通路,从而调节垂体腺瘤细胞的凋亡。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R736.4

【参考文献】