Epoxomicin通过内质网应激诱导前列腺癌细胞凋亡机制的研究

发布时间：2018-03-04 21:02

  本文选题：前列腺癌　切入点：DU-145细胞　出处：《南方医科大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景：前列腺癌发病率在美国占男性肿瘤发病的第一位,死亡率占男性肿瘤死亡原因的第二位。目前由于中国人口老龄化,前列腺癌的发病率明显增加。在我国前列腺癌发病、死亡分别集中在60-84岁和75-85岁以上癌是雄激素依赖性疾病,因此阻断雄激素受体信号是前列腺癌治疗的标志。许多患者最初从一线内分泌去势治疗获益,而内分泌治疗最终也只能让患者有12-48个月的缓解期,缓解期时间长短与肿瘤负荷,宿主因素,肿瘤本身的生物学特性等有关。一旦肿瘤进展,也就是我们临床上熟知的去势治疗抵抗性前列腺癌(CRPC),这往往是致命的。尽管目前多学科综合治疗手段包括新型二线内分泌治疗、化疗药物与生物治疗等使CRPC的治疗效果有所改善,但其适用范围窄、费用较高等特点使受益患者的数量有限,总的生存率仍不容乐观。因此,寻找新靶点的抗癌药物成为研究热点。蛋白酶体抑制剂作用于泛素-蛋白酶体通路从而发挥抗肿瘤作用。蛋白酶体抑制剂增加了促凋亡蛋白水平,降低了抗凋亡蛋白的水平,从而导致细胞周期停滞和细胞凋亡。重要的是,已经表明,在多种人类肿瘤细胞中进行测试发现,蛋白酶抑制剂相对于标准细胞毒性剂表现出更有效的细胞凋亡诱导能力。蛋白酶体抑制剂是通过选择性有效增敏化疗/放射治疗策略,也是选择性地以正常组织最小的附带损伤靶向作用于癌细胞从而克服其耐药性。因此,这些研究结果提供了令人信服的证据,表明泛素-蛋白酶体靶向途径与是人类恶性肿瘤的治疗中有效的武器。一个新的高度选择性的,不可逆的环氧酮类epoxomicin (EPO,环氧甲酮四肽蛋白酶体抑制剂)类似物-Carfilzomib被开发,与硼替佐米不同,是蛋白酶体抑制活性的新天然化合物,同时还是化疗/放射增敏剂,并于2012年FDA批准用于难治多发性骨髓瘤的治疗。它具有鲜明的作用机制,其特点在于具有鲜明的作用机制,其中环氧酮的官能团和THR1形成了一个独特的吗啉环系统来起到抑制作用,其不可逆地结合至20S蛋白酶体苏氨酸末端活性部位,从而抑制蛋白酶体的活性。由于没有其它蛋白酶N-末端的亲核残基能够作为其活性位点的一部分,这也体现出epoxomicin对蛋白酶体的独特特异性。与其他的蛋白酶体抑制剂不同的是,此类化合物对蛋白酶体的抑制是特异性的,不抑制蛋白酶体以外的其他蛋白酶,这是由其特殊的抑制机制决定的。比起硼酸类药物其结合更具有特异性,更具有稳定性,且避免了外周神经毒性。也正是由于此药物的特殊性,使其成为新一代蛋白酶体抑制剂,也成为实体瘤治疗方面的研究热点。蛋白酶体抑制剂可通过多种作用机制诱导肿瘤细胞的凋亡,其中可激活头颈部肿瘤,骨髓瘤细胞等肿瘤细胞的内质网应激,然而蛋白酶体抑制剂所致的内质网应激机制及与细胞凋亡的关系仍不明确,在前列腺癌中更未见报道。目前引起肿瘤细胞凋亡3条途径被认可：死亡受体介导的细胞凋亡,也称外源性凋亡途径；线粒体依赖的细胞凋亡,也称内源性细胞凋亡以及内质网介导的细胞凋亡。内质网应激诱导细胞凋亡的过程是复杂的,有内质网、线粒体等多个细胞器参与,涉及到多条信号传导通路。内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ER stress)就是指由于缺氧,热休克,其他物理或者化学因素导致内质网异常蛋白的聚集。通过内质网膜受体可以检测到非折叠蛋白的聚集也就是非折叠蛋白反应(unfolded protein response, URP)。这个复杂的细胞内反应是通过内质网膜三个受体介导,PERK, ATF6, IRE1。内质网应激的初始阶段,GRP78从这三个感受器游离,导致大量的游离GRP78产生,表达明显升高,这也是ER-stress激活的表现。三条UPR反应途径均可激活CHOP产生,这也是内质网应激的中心调节者,在持续内质网应激存在的状态下,它的表达水平也明显升高。目前研究发现内质网应激诱导凋亡主要通过三种途径：CHOP途径、ASK1(apoptosis signal-regulating kinase l)-JNK(ciun N-terminal kinase)途径和Caspase-12途径。因此CHOP途径是内质网应激诱导凋亡的主要途径之一。基于上述,本课题研究蛋白酶体抑制剂epoxomicin(EPO)对前列腺癌非激素依赖细胞DU-145作用,并研究其与内质网应激之间的关系,以及内质网应激凋亡蛋白CHOP对细胞凋亡的影响等。从而探讨并说明epoxomicin对前列腺癌非激素依赖DU-145细胞的影响及作用机制,为我们临床治疗提供实验室基础。目的：1.研究epoxomicin对前列腺癌细胞增殖的作用以及对细胞凋亡的影响。2.通过研究epoxomicin对前列腺癌细胞内质网应激分子标记GRP78, CHOP, XBP-ls基因转录影响以及对GRP78, CHOP蛋白影响,从而初步探讨其作用机制。3.探讨4-PBA阻断剂对epoxomicin诱导细胞内质网应激的影响。4.沉默基因CHOP后epoxomicin对前列腺癌细胞生长的影响及对细胞凋亡的影响,从而探讨epoxomicin诱导细胞凋亡的机制。方法：1.MTS法检测及形态学观察蛋白酶体抑制剂EPO对前列腺癌DU-145作用：处理组加入不同浓度的EPO(0.8,4,10,20,100nM),并予以不同的处理时间(24,48,72小时)。实验终点分别用MTS法检测不同剂量的蛋白酶体抑制剂EPO,作用不同时间对前列腺癌DU-145细胞增殖的影响,对活细胞数目的影响。通过倒置显微镜从形态学观察对DU-145细胞的影响。2. Annexin-V/PI检测对DU-145细胞凋亡的影响：实验组加入EPO10、20nM,24小时后收集细胞,通过Annexin-V/PI检测EPO10、20nM作用24小时后DU-145细胞凋亡情况。3.实时荧光定量PCR法检测CHOP、GRP78、XBP-1及XBP-ls基因变化：EPO10、20nM作用24、48、72小时后检测CHOP、GRP78、XBP-ls基因的变化情况；EPO20nM作用6、12、24、36小时后XBP-1及XBP-1s基因变化情况。4.Western-blotting法检测CHOP、GRP78蛋白含量的变化：EPO10、20nM作用24、48、72小时后Western-blotting法检测CHOP、GRP78蛋白含量的变化。5.4-PBA阻断剂与EPO对前列腺癌DU-145细胞的影响作用：4-PBA作用1小时后联合使用EPO对前列腺癌DU-145细胞对CHOP、GRP78基因转录影响；4-PBA作用后1小时后联合使用EPO对前列腺癌DU-145细胞生长的影响。6.CHOP基因沉默后EPO对DU-145细胞的影响：CHOPsiRNA沉默基因CHOP后,EPO20nM对DU-145细胞生长、细胞凋亡的影响。7.统计学方法：实验数据均以SPSS17.0统计软件分析,数据用均数±标准差(x±s)表示。细胞增殖、基因转录及蛋白水平与时间关系采用2因素析因分析方差分析；基因转录及蛋白水平与对照组之间的比较采用95%的可信区间；其他用单因素方差分析(One-Way ANOVA),组间数据方差齐性时采用Student-Newman-Keuls检验,方差不齐时采用近似F检验(Welch方法)及多重比较的Dunnett'S T3方法。P0.05认为有统计学意义。结果：1.EPO对前列腺癌DU-145细胞增殖的抑制作用：不同组别活细胞数目比较差异有统计学意义(F=160.640,P0.001)；不同时间点活细胞数目比较差异无统计学意义(F=1.335,P=0.267)；时间和组间交互作用有统计学意义(F=22.784,P0.001)；EPO 0.8nM处理组与正常对照组对应时间比较差异无统计学意义(P0.05)；EPO 4、10 nM第2、3天活性细胞数量与对照组比较,细胞数量下降明显(P0.05)；EPO 20nM及EPO 100nM组活细胞数目与对照组第1、2、3天均明显下降,差异有显著统计学意义(P0.05)。倒置显微镜观察发现梭形细胞形态有所变化,成为多边形或者类圆形,细胞数目明显减少。2.对DU-145细胞凋亡的影响：EPO10nM及20nM组凋亡率分别为(25.04±3.21)%、(38.81±4.94)%,与对照组(5.51±0.61)%相比差异有统计学意义(P0.05),同时也发现EPO20nM组凋亡率与EPO 10nM组比较,差异有统计学意义(P0.05)。3. CHOP、GRP78、XBP-1及XBP-1s基因变化：不同浓度EPO处理后各基因表达差异有统计学意义(CHOP:F=15.669, P0.01; XBP-1s:F=12.724, P 0.01; GRP78:F=31.624, P0.01); EPO处理不同时间各组各基因表达差异有统计学意义(CHOP:F=241.982, P0.001; XBP-1s:F=91.382, P0.001; GRP78:F=101.657,P0.001);EPO处理不同浓度与不同时间CHOP、GRP78基因表达存在交互作用(CHOP:F=9.635,P=0.003;GRP78:F=15.521,P0.001); EPO处理不同浓度与不同时间XBP-1s基因水平无交互作用(F=3.569,P=0.061)。与对照组比较采用95%的可信区间,CHOP、GRP78及XBP-1smRNA表达在24、48、72h处理组明显高于对照组。单因素方差分析48h EPOlOnM组与20nM组比较,CHOP、XBP-1smRNA表达差异有统计学意义(P0.05)；48、72 h两组GRP78mRNA比较差异有统计学意义(P0.05)。XBP-1及XBP-1s mRNA两者不同时间差异有统计学意义(F=724.225,P0.001)。同一时间XBP-1及XBP-1s mRNA差异有统计学意义(F=219.593,P0.001),XBP-1及XBP-1s mRNA转录水平与时间之间有交互作用(F=202.587,P0.001)。单因素方差分析XBP-1及XBP-1smRNA从6h开始同一时间两者之间差异均有统计学意义(P0.01)。不同时间两者与对照组比较采用95%可信区间,结果显示6、12、24、36h两者表达水平明显高于对照组。4. CHOP、GRP78蛋白含量的变化：不同浓度EPO处理后蛋白水平差异有统计学意义(CHOP:F=46.148,P0.001; GRP78:F=46.148, P0.001);EPO处理不同时间各组差异有统计学意义(CHOP:F=161.677,P0.001;GRP78:F=80.982,P0.001)；EPO处理不同浓度与不同时间CHOP蛋白存在交互作用(F=21.941,P0.05)。EPO处理不同浓度与不同时间GRP78蛋白无交互作用(F=3.594,P=0.060)。单独效应分析,EPO处理组与对照组比较,采用95%的可信区间,24、48、72h后EPO处理组CHOP、GRP78蛋白明显高于对照组；72h EPO 20nM组与10nM组CHOP蛋白比较差异有统计学意义(F=27.475,P=0.003)；24h、72h两组比较GRP78蛋白差异有统计学意义(24h.F=24.332,P0.05；72h.F=17.824,P0.05)。5.4-PBA阻断剂与EPO对前列腺癌DU-145细胞的影响作用：与对照组比较采用95%可信区间,PBA1、3mM单用组CHOP、GRP78mRNA表达与对照组比较,无明显变化；其他组间比较采用单因素方差分析,PBA1、3mM联合EPO20nM组与EPO组比较,表达显著下降,差异有统计学意义(P0.05)。PBAlmM联合EPO 20nM活细胞数目较EPO20nM组增加,但活细胞数目仍低于对照组,差异有统计学意义(P0.05)：而PBAlmM联合EPO 4nM处理,活细胞数目与正常组比较差异无统计学意义(P0.05),活细胞数目高于EP04nM组,差异有统计学意义(P0.05)；PBA3mM联合EPO 4、20nM其活细胞数目与相应EPO组比较差异无统计学意义(P0.05),与对照组比较,差异有统计学意义(P0.05)。6. CHOP基因沉默后EPO对DU145细胞的影响：与对照组比,沉默基因CHOP后CHOP基因、蛋白水平NS+EPO组及EPO组明显增加：两组间比较差异无统计学意义(P0.05)。CHOPsiRNA10及50nM联合EPO组,CHOP基因表达、蛋白水平与对照组比较差异无统计学意义；与EPO组比较差异有统计学意义(P0.01)。证实我们基因沉默是成功的。沉默基因CHOP后,CHOPsiRNA10、 50nM+EPO20nM组细胞数目较EPO20nM组增多,差异有统计学意义(P0.05),50nM组更为明显,但两组细胞数目都仍低于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。CHOP基因沉默后EPO处理DU-145细胞,其凋亡率(21.96±2.31)%,显著高于正常组,但低于EPO组,差异有统计学意义(P.01)。结论：1.EPO对前列腺癌DU-145细胞具有明显的抑制作用,呈现浓度时间依赖性；细胞形态学上进一步说明EPO对DU-145细胞具有杀伤作用；EPO引起前列腺癌DU-145细胞凋亡,随着EPO浓度增加,凋亡率也增加。2.EPO导致DU-145细胞产生内质网应激,其分子标志CHOP、GPR78、XBP-ls转录水平明显升高,随着时间这三个转录基因水平逐渐升高。EPO可导致DU-145细胞XBP-1s明显升高,且随着时间变化明显,而XBP-1变化不明显。EPO激发蛋白GRP78、CHOP水平明显升高,随着时间逐渐升高,72小时20nM组与10nM组比较,差异有统计学意义。3.4-PBA可阻断EPO诱导的DU-145细胞内质网应激CHOP、GRP78基因转录水平的表达：阻断EPO诱导的DU-145细胞数目的减少。这两点也恰恰证明了EPO诱导DU-145产生了内质网应激。4. CHOP基因沉默后CHOP基因表达及蛋白水平明显下降,说明我们所用的方法沉默基因CHOP是成功的；CHOP基因沉默后EPO对DU-145细胞生长抑制部分被阻断；细胞凋亡也部分被阻断,说明CHOP是EPO诱导DU-145细胞凋亡的重要基因。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.25
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本文编号：1567282