TEOA抗人结肠癌细胞作用机制的初步研究
本文选题：毛花猕猴桃根 切入点：TEOA 出处：《浙江大学》2017年硕士论文 论文类型：学位论文
【摘要】：近年来,结肠癌发病率呈现明显的逐年增长趋势,成为人类高发恶性肿瘤之一。手术是其治疗的首选方法,但术后各种并发症发生较多,有效的临床药物也有所欠缺。随着结肠癌患者人数增加,死亡率较高,抗结肠癌药物的研发越来越受到科研工作者的重视。五环三萜类化合物的抗肿瘤活性已经获得广泛认可,2α,3α,24-三羟基-12-烯-28-乌苏酸(TEOA),是从畲族习用抗肿瘤中草药毛花猕猴桃根中提取出的五环三萜类化合物。我们课题组的前期研究结果及相关文献报道证明了 TEOA具有明显的抗肿瘤、抗炎、抗病毒作用,但关于其作用机理的研究鲜有报道。自噬性细胞死亡通常被称为Ⅱ型程序性死亡,通过自噬体与溶酶体结合形成自噬溶酶体,将包裹的细胞器和蛋白消化、降解、吞噬。探究药物诱导肿瘤细胞发生自噬性细胞死亡作用机制,对寻找治疗癌症临床药物有重要意义。本研究选取三株不同人源的结肠癌细胞为研究对象,探究TEOA抗人结肠癌细胞作用机制,进而为TEOA的新药开发及临床应用提供更深入的理论依据。1..TEOA对三株人结肠癌细胞的生长、增殖抑制作用及形态学观察本章以三株不同类型不同蛋白表达的人结肠癌细胞株SW620、SW480、HCT116细胞为研究对象,采用MTT法考察不同药物浓度、不同作用时间TEOA对人结肠癌的生长抑制率;利用平板克隆实验考察TEOA对人结肠癌SW620、SW480、HCT116细胞增殖能力的影响;运用结晶紫染色,在光学显微镜下观察TEOA对人结肠癌细胞形态学影响。结果显示,TEOA对三株人结肠癌SW620、SW480、HCT116细胞的生长抑制呈剂量依赖性,能够抑制三株结肠癌细胞的增殖,诱导三株人结肠癌细胞系(SW620、SW480、HCT116)产生不同程度的空泡现象。2.TEOA抗人结肠癌SW620细胞作用机制探讨采用流式细胞仪PI/Annexin V-FITC双染色法测不同TEOA浓度作用后人结肠癌SW620细胞凋亡率;利用western blot技术检测凋亡标志性蛋白caspase-9和PARP蛋白表达水平。结果显示TEOA能引起人结肠癌SW620早凋和晚凋,并且凋亡率呈现剂量依赖性;TEOA激活了凋亡标志性蛋白capase-9和PARP蛋白的剪切,并且蛋白表达量随TEOA剂量的增加而逐渐增加。综合实验结果可以初步说明TEOA能诱导人结肠癌SW620细胞凋亡。采用MDC染色法检测不同药物浓度TEOA作用后,人结肠癌SW620细胞产生的自噬小体数量;运用western blot检测自噬标志性蛋白LC3-Ⅱ及p62表达量;结果显示,药物处理后人结肠癌SW620细胞内成熟自噬小体的数量随TEOA浓度的增高而增加;TEOA明显促进了自噬标志性蛋白LC3-Ⅱ及p62蛋白的表达,并具有剂量依赖性。利用MTT、流式细胞仪PI/AnnexinV-FITC双染色法、western blot考察加入自噬抑制剂3-MA后,人结肠癌SW620细胞存活率、凋亡率以及凋亡标志蛋白表达水平。结果显示,细胞自噬被抑制后,人结肠癌SW620细胞存活率、凋亡率以及凋亡标志蛋白PARP表达水平都没有明显提高。综合上述实验结果,说明TEOA引发人结肠癌SW620细胞发生自噬性死亡。运用western blot技术检测内质网应激通路上相关蛋白(PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、CHOP)及线粒体自噬相关蛋白(p62、Parkin、PINK1)的表达水平,利用荧光探针DCFH-DA进行细胞内活性氧(ROS)检测。结果显示TEOA能够使p-PERK、p-eIF2α、CHOP蛋白表达量上调并且呈现剂量依赖性,PERK、eIF2α蛋白表达量不变;加入自噬抑制剂3-MA后,PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、CHOP蛋白表达量变化不明显;说明TEOA可剂量性提高p62、Parkin、PINK1蛋白表达水平,自噬抑制后,线粒体自噬相关蛋白表达量变化趋势不明显;流式细胞仪结果显示TEOA药物作用后,人结肠癌SW620细胞内ROS升高,伴随剂量依赖性;根据上述实验结果可以推测TEOA通过内质网应激PERK/eIF2α/CHOP通路及ROS介导的线粒体自噬p62/Parkin/PINK1通路诱导人结肠癌SW620细胞发生自噬性死亡。3.TEOA抗人结肠癌SW480细胞作用机制初步探索本部分利用免疫荧光显微镜检测不同药物浓度TEOA作用后,人结肠癌SW480细胞内被MDC染色的自噬小体的数量;Western blot检测自噬标志性蛋白LC3-Ⅱ、p62蛋白表达量变化及内质网应激相关蛋白表达水平。结果显示,TEOA浓度越高,人结肠癌SW480细胞荧光强度越强,自噬小体越多;TEOA能够提升LC3-Ⅱ、p62蛋白表达水平;内质网应激相关蛋白GRP78、p-PERK和p-eIF2α蛋白表达水平提高,而PERK和eIF2α总蛋白表达量不变;综合上述实验结果可推测TEOA诱导人结肠癌SW480细胞发生自噬,TEOA浓度越高,细胞自噬程度越大;TEOA可能是通过内质网应激GRP78/PERK/eIF2α/CHOP通路诱发人结肠癌SW480细胞自噬死亡。本文通过不同的实验对TEOA诱导人结肠癌细胞自噬的作用途径进行论证,为开发治疗结肠癌的新药提供临床和理论依据。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.35
【参考文献】
相关期刊论文 前10条
1 董晶;郭勇;方红明;王辉;;复方藤梨根制剂对小鼠CT26移植瘤生长及对MVD影响的研究[J];中华中医药学刊;2014年07期
2 于阳;孙桂芝;;孙桂芝教授运用虫类药治疗肿瘤经验[J];中华中医药杂志;2014年03期
3 国宏莉;李江华;李斌;徐臣利;田林;;两种藤梨根制剂促凋亡作用的实验研究[J];贵州医药;2013年08期
4 何好臣;方勇;郭勇;徐玲;吕俊海;;复方藤梨根制剂对人胃癌裸鼠腹腔移植瘤NF-κB p65表达的影响[J];中国医药导报;2012年29期
5 王岚;康琛;杨伟鹏;李曼铃;王彦礼;王怡薇;黄璐琦;梁日欣;杨庆;殷小杰;;藤梨根正丁醇提取物和总黄酮苷抗肿瘤作用研究[J];中国中药杂志;2010年16期
6 梁洁;甄汉深;王新盛;钟振国;张薇薇;李生茂;李吾来;;美味猕猴桃根中三萜类化合物的体外抗肿瘤实验研究[J];中药材;2009年06期
7 杨艳杰;何弘水;;华美二号猕猴桃根提取物保肝作用的实验研究[J];食品科技;2009年01期
8 林国彪;张雯艳;张凤芬;陈希慧;黄初升;钟振国;;山梨猕猴桃根提取物抗肿瘤活性研究[J];时珍国医国药;2008年03期
9 黄瑾;郑玉建;王维山;包晓玲;;狗枣猕猴桃根对小鼠抗氧化作用[J];中国公共卫生;2008年01期
10 楼丽君;吕定量;胡增仁;钟松阳;唐卫东;徐永平;;猕猴桃根抗肿瘤作用研究[J];中国药理学通报;2007年06期
相关博士学位论文 前1条
1 徐一新;中药藤梨根和猫人参活性成分研究[D];第二军医大学;2010年
相关硕士学位论文 前5条
1 卢泳庄;毛花猕猴桃根活性部位与活性成分制备及其抗肿瘤活性研究[D];浙江大学;2015年
2 张琳;中华猕猴桃根化学成分及其生物活性研究[D];西北农林科技大学;2015年
3 郭辉辉;毛花猕猴桃氯仿层单体化合物分离及其抗肿瘤活性机制研究[D];浙江理工大学;2013年
4 陈晓晓;中华猕猴桃根化学成分研究[D];济南大学;2011年
5 邹游;猕猴桃品种间的遗传多样性分析[D];四川大学;2007年
，本文编号：1567564
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/zlx/1567564.html
