miR-424-5p在非小细胞肺癌细胞A549中的作用及调节研究

发布时间：2018-03-04 23:03

本文选题：miR-424-5p　切入点：NSCLC　出处：《内蒙古大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：MicroRNAs(miRNAs)是一类小的内源性单链非编码RNA,主要通过与靶基因mRNA的3'非翻译区配对来降解靶基因mRNA或抑制其表达,实现转录后水平的基因表达调控。近年来,microRNAs在肿瘤发生、发展中的作用使其逐渐成为肿瘤检测标记和癌症治疗潜在靶标而受到广泛研究。MiR-424-5p被报道在多种肿瘤中异常调节,但是其在人类非小细胞肺癌(NSCLC)中的作用和分子机制研究还有待明确。本文主要研究了 miR-424-5p在NSCLC细胞A549中的作用及其相关分子机制。1、miR-424-5p在肺癌细胞中的表达及对肺癌细胞A549的影响本研究首先利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测miR-424-5p在非小细胞肺癌细胞系A549和H460中的表达。结果表明,与正常支气管上皮细胞HBE相比,miR-424-5p在A549中的表达明显升高,而在H460细胞中的表达无显著差异,因此本实验选择A549细胞进行后续研究。其次,设计合成miR-424-5p的抑制物(miR-424-5p inhibitor),利用脂质体转染的方法将其转入A549细胞中,通过转染荧光对照确定最适转染浓度,根据转染24h后的荧光强度选择100 nM为miR-424-5p inhibitor的最佳转染浓度。最后,利用RT-qPCR的方法检测转染miR-424-5p inhibitor后对miR-424-5p表达的抑制效率,结果显示miR-424-5p的表达水平降低了 34.74%(P0.05)。本研究同时检测了 miR-424-5p对肿瘤细胞恶性表型的影响。CCK-8实验结果表明抑制miR-424-5p后,A549细胞的增殖受到明显抑制(P0.05),平板克隆实验表明抑制miR-424-5p后,A549细胞克隆形成数与对照组相比下降了52.11%(P0.05),流式分析结果表明抑制miR-424-5p后,A549细胞凋亡细胞数明显增加,约为对照组的5倍。利用划痕愈合实验和Transwell实验检测细胞迁移,结果表明抑制miR-424-5p后,与对照组相比,细胞划痕愈合能力减弱,A549细胞迁移率下降了 39.43%(P0.01),Transwell实验同时表明A549细胞的侵袭受到明显抑制,约为对照组的37.60%(P0.01)。2、miR-424-5p与靶基因CLOCK之间的相互作用为了研究miR-424-5p的作用途径,通过Targetscan等软件在线预测了miR-424-5p的靶基因,候选基因为ASH1L、CLOCK、RICTOR、WEE1、PPPP1R11、PDCD4、SOCS6和SUZ12。利用RT-qPCR方法检测了这些基因在HBE、A549及转染miR-424-5p后A549细胞中的表达,结果表明,ASH1L、CLOCK、PPPP1R11和PDCD4在A549细胞中的表达明显低于对照组(HBE)(P0.01),而在抑制miR-424-5p后的A549细胞中这些基因的表达明显升高(P0.01)。随后,利用双荧光素酶报告基因实验验证ASH1L、CLOCK、PPPP1R11和PDCD4是否为miR-424-5p的靶基因,结果表明CLOCK基因为miR-424-5p的一个靶基因。Western Blot结果表明转染miR-424-5p inhibitor后CLOCK蛋白表达明显升高(P0.01),这与mRNA的表达变化相一致,进一步证明CLOCK基因为miR-424-5p的靶基因。为了进一步分析miR-424-5p和CLOCK基因的相互作用关系,本研究利用基因编辑技术在A549细胞中过表达CLOCK基因。结果显示,过表达CLOCK后miR-424-5p的表达与对照组无显著差异,但是显著抑制了A549细胞的增殖、迁移和克隆形成能力。综上所述,miR-424-5p在肺癌细胞A549中高表达,抑制miR-424-5p的表达后,可降低A549细胞的增殖、迁移和侵袭能力,并促进细胞凋亡。确定CLOCK是miR-424-5p的一个靶基因,抑制miR-424-5p表达后CLOCK的mRNA表达和蛋白表达明显升高,而CLOCK基因的过表达虽然不影响miR-424-5p的表达,但显著抑制了细胞恶性表型。因此,miR-424-5p可能是通过调节CLOCK基因的表达来发挥作用。
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【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R734.2

【参考文献】