趋化因子CCL20诱导上皮间质转化在肝癌侵袭转移中的作用及机制研究

发布时间：2018-03-09 06:04

本文选题：肝细胞癌　切入点：肿瘤微环境　出处：《第二军医大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC;以下简称肝癌)位于常见肿瘤的第六位及肿瘤相关性死亡原因的第三位,且近年来呈逐渐上升趋势。虽然随着科学技术发展和外科技巧的提高,目前大多数早期肝癌都能得到根治性切除,但其5年总体生存率仍然很低。其中最重要的因素是肝癌具有极强的侵袭和转移能力,术后5年内极易出现肿瘤复发及远处转移。所以,肝癌术后复发转移是我们治疗肝癌的临床难题。肿瘤微环境是肿瘤细胞在生长过程中由肿瘤细胞及细胞外基质相互作用后形成的有利于肿瘤细胞生长的特殊环境,其组成成分包括肿瘤细胞、多种间质及炎性细胞、可溶性细胞因子、细胞外基质等。肿瘤微环境在肿瘤发展及转移的整个过程中扮演着重要的角色。上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指上皮细胞转变为具有间质表型细胞特点的生物学过程,目前广泛认为EMT是肿瘤侵袭转移的重要方式。趋化因子作为肿瘤微环境的一种成分,也参与了多种肿瘤的发生与发展。目前文献证明,趋化因子能够以诱导肿瘤细胞发生EMT样改变的方式促进肿瘤细胞侵袭及转移。CCL20,又被称为人巨噬细胞炎性蛋白3α(Macrophage inflammatory protein-3α),作为近年来研究热点的细胞因子,已被证明在肿瘤侵袭转移中起到非常重要的作用,其在肝癌侵袭转移中也扮演非常重要的角色。已有学者发现,CCL20可以与白介素8(Interleukin-8,又名CXCL8)协同作用,通过介导肿瘤细胞EMT样改变,促进肠癌细胞侵袭转移。另一方面,我们的前期研究结果显示,肝癌微环境中的肿瘤相关成纤维细胞条件培养基与肝癌细胞共培养能够显著增强肝癌细胞的侵袭转移能力,推测可能是由于肿瘤相关成纤维细胞通过自分泌方式影响肝癌细胞的生物学行为。研究表明,肿瘤相关成纤维细胞能够分泌包括趋化因子CCL20在内的多种细胞因子。细胞凋亡(Apoptosis)是一种细胞程序化死亡(Programmed cell death,PCD),是指在一定的病理及生理条件下,细胞遵循于自身程序的生理性死亡过程。细胞凋亡被抑制是肿瘤细胞存活并发生转移的先决条件。研究证实,趋化因子与细胞凋亡在肝癌发生、发展过程中亦发挥作用。血管内皮生长因子相关因子1(Vascular endothelial growth factor-correlated chemokine 1,VCC-1)作为一种趋化因子,被证实与肝癌细胞增殖能力呈正相关,并且抑制肿瘤细胞凋亡。基于上述研究背景,我们推测,肝癌微环境中趋化因子CCL20亦可能通过促进肝癌细胞发生EMT的方式促进肝癌细胞侵袭转移,同时抑制肝癌细胞凋亡。为了验证此假说,本课题主要从以下几个方面开展研究:1、检测正常肝细胞LO2和多种肝癌细胞系包括Hep G2、MHCC-97H、Hep3B、SMMC-7721和Huh7中CCL20蛋白表达情况,并筛选高表达肝癌细胞株用于后续实验;2、分别采用细胞因子CCL20和干扰载体si RNA-CCL20处理肝癌细胞,观察肝癌细胞的形态学以及生物学特性改变,采用细胞免疫荧光检测肝癌细胞中EMT相关蛋白(E-cadherin、Vimentin)表达差异;3、采用MTT、Transwell及Wound-healing等实验检测CCL20/si RNA-CCL20处理后肝癌细胞侵袭迁移能力的改变;4、采用Western blot检测EMT相关蛋白及信号通路相关蛋白表达变化,探讨可能涉及的信号通路和分子机制;5、采集临床肝癌组织标本,采用免疫组织化学方法检测肝癌组织以及配对癌旁肝组织中CCL20蛋白以及EMT相关蛋白表达情况;6、收集相关肝癌患者的临床病理学资料,并随访,进行数据分析及统计学处理,获得CCL20与肝癌患者临床相关指标、EMT相关标志物以及肝癌患者临床预后之间的相关性实验证据。本课题主要分为三个部分:第一部分CCL20通过诱导肝癌细胞发生EMT样改变促进肝癌细胞侵袭转移目的:获取CCL20诱导肝癌细胞发生EMT样改变促进其侵袭和转移的实验证据。方法:首先通过Western blot方法检测正常肝细胞LO2与不同肝癌细胞系(Hep G2、MHCC-97H、Hep3B、SMMC-7721和Huh7)中的CCL20蛋白表达,得到高表达CCL20蛋白的肝癌细胞系,然后通过MTT、Transwell等实验检测CCL20对肝癌细胞增殖和侵袭能力的变化,同时用外源性细胞因子CCL20与肝癌细胞共培养后,显微镜下观察细胞形态的变化。结果:Western blot检测肝癌细胞中CCL20蛋白的表达显著高于正常肝细胞,且Hep3B中的CCL20蛋白表达量最高,用于后续实验;MTT实验结果显示,CCL20能够促进肝癌Hep3B细胞体外增殖作用,并且有时间依赖性及剂量依赖性;Transwell实验证明,CCL20可以增强肝癌细胞的侵袭能力,并且与CCL20浓度呈正相关;将CCL20与肝癌细胞培养48 h后,肝癌细胞形态形态发生了明显变化,细胞间隙增加,细胞形态从多边立方形转变为长梭形的EMT样改变。结论:CCL20能够通过诱导肝癌细胞发生EMT样改变促进肝癌细胞的侵袭及增殖能力。第二部分下调CCL20表达可抑制肝癌细胞增殖、侵袭迁移和凋亡等生物学特性目的:验证si RNA-CCL20具有抑制肝癌细胞增殖、侵袭迁移和凋亡等生物学特性的作用。方法:首先通过MTT、Transwell、细胞划痕等实验检测si RNA-CCL20对肝癌细胞增殖、侵袭迁移能力的影响;然后通过细胞免疫荧光检测下调趋化因子CCL20后肝癌细胞中EMT相关蛋白(E-cadherin、Vimentin)表达情况的变化;接下来采用Western blot检测EMT相关蛋白及可能存在的信号通路相关蛋白的表达变化;最后应用Western blot及流式细胞术检测si RNA-CCL20对肝癌细胞凋亡及相关蛋白表达的影响。结果:MTT、Transwell、细胞划痕实验结果显示,与空白组和质粒对照组相比较,si RNA-CCL20能够对肝癌Hep3B细胞增殖、侵袭及迁移能力具有显著的抑制作用;si RNA-CCL20处理肝癌Hep3B细胞48 h后,肝癌细胞间质细胞标志物波形蛋白(Vimentin)表达下调,上皮细胞标志物E-钙粘蛋白(E-cadherin)表达上升,p-Akt表达上调,而p-ERK几乎无变化;Western blot及流式细胞术结果显示,相比较于空白对照组和质粒对照组,si RNA-CCL20处理组的肝癌Hep3B细胞凋亡率显著增加,与此同时凋亡相关指标Cleaved caspase-3表达量增高,而B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)的表达量降低。结论:下调肝癌细胞中CCL20表达能够显著抑制肝癌Hep3B细胞增殖、侵袭迁移和凋亡等生物学特性,可能通过PI3K/Akt信号通路发挥作用。第三部分肝癌组织高表达CCL20蛋白是预测肝癌预后的一个潜在指标目的:研究肝癌组织中CCL20、EMT相关蛋白表达水平与临床病理学指标及预后的相关性。方法:采用免疫组化法检测CCL20、E-cadherin及Vimentin在肝癌组织及配对癌旁组织中的表达水平,并根据CCL20染色程度将102例肝癌患者分为高表达组及低表达组,然后分别将其与EMT相关蛋白、患者的临床病理学资料进行相关性分析;采用多因素回归分析预测肝癌不良预后的指标,并通过采用Kaplan-Meier法和Log-Rank检验对比两组患者的总生存率及无复发生存率。结果:CCL20蛋白表达于肝癌细胞胞浆内,在肝癌组织中的阳性表达率为77.45%(79/102),在癌旁肝组织中的阳性表达率为20.59%(21/102)。CCL20蛋白阳性表达的肝癌组E-cadherin表达降低,Vimentin表达增加。102个患者可分为CCL20蛋白高表达组(64/102)和低表达组(38/102),其高表达CCL20组与E-cadherin的表达呈负相关(13/64,20.31%,P0.001),而与Vimentin表达呈正相关(60/64,93.75%,P0.001)。进一步与患者的临床病理学资料相关性分析得出,CCL20蛋白表达与肿瘤大小(P=0.001)、血管侵犯(P=0.025)、肝内转移(P=0.002)和远处转移(P=0.000)具有显著相关性。多因素Cox回归分析发现,CCL20蛋白表达、血管侵犯、肝内转移和远处转移能够显著影响肝癌患者的总生存率和无瘤生存率。与低表达CCL20蛋白组相比,高表达组总生存率(P=0.011)和无复发生存率(P=0.008)均显著减少。结论:肝癌组织中CCL20蛋白表达显著增高,与EMT相关蛋白表达改变存在相关性,并且肝癌组织中CCL20蛋白表达增高与肝癌术后预后不良呈相关性,有可能作为临床预后预测的一个新靶标。全文结论:CCL20蛋白在肝癌细胞中呈现高表达状态,并且通过诱导肝癌细胞发生EMT样改变及抑制细胞凋亡的方式增强肝癌细胞增殖、侵袭转移能力,其机制可能是通过PI3K/Akt信号通路调控。临床试验进一步证明,CCL20蛋白在肝癌组织中高表达,且与EMT标志物相关蛋白存在相关性。CCL20蛋白表达水平与肝癌临床病理指标及患者的总体生存率和无复发生存率存在明显的相关性。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7

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