索拉非尼诱导miR-375的表达上调抑制肝癌新生血管生成的功能和机制研究

发布时间：2018-03-09 07:49

  本文选题：索拉非尼　切入点：miR-375　出处：《西南医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:利用miRNA芯片和qRT-PCR筛选和确认索拉非尼处理前后的肝癌细胞中差异性表达的miRNAs。初步探索上述差异表达miRNAs对肝癌新生血管生成的调控功能和潜在分子机制。方法:第一部分、索拉非尼诱导肝癌细胞miR-375表达上调1.加入不同浓度的索拉非尼处理Hep3B、Hep G2 48h,明确索拉非尼对Hep3B、Hep G2的IC50;2.提取索拉非尼处理前后的肝癌细胞的RNA行miRNA芯片检测分析,筛选差异表达的miRNAs;3.miRNA芯片筛选出miR-375等差异表达miRNAs的基础上,利用qRT-PCR检测不同浓度的索拉非尼处理前后肝癌细胞中miR-375的表达变化;第二部分、miR-375抑制肝癌新生血管生成的功能和机制研究1.利用qRT-PCR检测临床肝癌组织和癌旁组织中;肝癌细胞系Hep3B、Hep G2、Huh1、Huh7和正常肝细胞系LO2中miR-375的表达差异;2.利用过表达miR-375的慢病毒感染肝癌细胞,并用qRT-PCR确认miR-375在肝癌细胞中的过表达效率;3.利用CCK-8增殖实验、克隆形成实验、Transwell实验、划痕实验、凋亡实验检测miR-375对肝癌细胞增殖、克隆形成、侵袭、迁移、凋亡的影响;4.利用HUVEC血管管腔形成实验、大鼠主动脉环出芽实验、鸡胚绒毛尿素膜血管生成实验在体外和体内水平分别检测miR-375对肝癌新生血管生成的影响;5.在生物信息学软件预测miR-375的潜在下游靶基因PDGFC的基础上,利用qRT-PCR、Western blotting、IHC检测临床肝癌组织和癌旁组织中PDGFC的表达差异;6.利用qRT-PCR、Western blotting检测肝癌细胞系Hep3B、Hep G2、Huh1、Huh7和正常肝细胞系LO2中PDGFC的表达差异;利用慢病毒载体和miR-375的抑制物分别在肝癌细胞中过表达和下调表达miR-375,利用qRT-PCR、Western blotting和Elisa检测PDGFC的表达变化,明确miR-375对PDGFC的调控功能;7.利用双荧光素酶实验明确miR-375对PDGFC调控的分子机制;8.在肝癌细胞过表达miR-375的同时外源性补充人重组PDGFCC蛋白和用RNAi实验敲除PDGFC,利用HUVEC血管管腔形成、大鼠主动脉环出芽和鸡胚绒毛膜尿素膜血管生成等“挽救实验”明确miR-375是否通过直接调控PDGFC的表达抑制肝癌新生血管的生成;9.利用裸鼠成瘤实验在整体动物水平检测miR-375对裸鼠肿瘤生长、血管生成及生存时间的影响;10.在索拉非尼处理肝癌细胞的同时,采用miR-375的抑制物下调表达miR-375,利用qRT-PCR和Western blottng检测PDGFC的表达变化;明确索拉非尼是否通过诱导miR-375表达上调抑制PDGFC的表达;第三部分、miR-375调控肝癌细胞PDGFC下游信号通路的初步研究利用Western blotting检测过表达和下调表达miR-375后AKT,ERK1/2的磷酸化水平;结果:第一部分、索拉非尼诱导肝癌细胞miR-375表达上调1.索拉非尼对Hep3B、Hep G2的IC50分别为2.77u M、3.28u M;2.miRNA芯片结果显示:索拉非尼可诱导包括miR-375在内的miRNAs表达上调;3.qRT-PCR结果显示:索拉非尼浓度依赖性诱导肝癌细胞miR-375表达上调;第二部分、miR-375抑制肝癌新生血管生成的功能和机制研究1.qRT-PCR结果显示:miR-375在临床肝癌组织中的表达明显低于癌旁组织,miR-375在肝癌细胞系Hep3B、Hep G2、Huh1、Huh7中的表达明显低于正常肝细胞系LO2;2.慢病毒感染后见大量绿色荧光蛋白表达,qRT-PCR结果显示:miR-375过表达成功;3.CCK-8增殖实验和克隆形成实验结果显示:miR-375明显抑制肝癌细胞的增殖能力和克隆形成能力;Transwell侵袭实验结果显示:miR-375明显抑制肝癌细胞的侵袭能力;Transwell迁移实验、划痕实验结果显示:miR-375明显抑制肝癌细胞的迁移能力;凋亡实验结果显示:miR-375明显促进肝癌细胞凋亡;4.HUVEC血管管腔形成实验结果显示:miR-375明显抑制HUVEC血管管腔形成;大鼠主动脉环出芽实验结果显示:miR-375明显抑制大鼠主动脉环的出芽及生长;鸡胚绒毛尿素膜血管生成实验结果显示:miR-375明显抑制鸡胚绒毛尿素膜血管生成;5.生物信息学软件targetscan 7.1预测PDGFC可能是miR-375的下游靶基因;qRT-PCR、Western blotting、IHC结果显示:临床肝癌组织中PDGFC的表达明显高于癌旁组织;6.qRT-PCR、Western blotting结果显示:肝癌细胞系Hep3B、Hep G2、Huh1、Huh7中PDGFC的表达明显高于正常肝细胞系LO2;qRT-PCR、Western blotting、Elisa结果显示:过表达miR-375后PDGFC的表达下降,抑制miR-375表达后PDGFC的表达升高;7.双荧光素酶报告实验结果显示:miR-375直接作用于PDGFC-3,UTR;8.HUVEC血管管腔形成、大鼠主动脉环出芽、鸡胚绒毛膜尿素膜血管生成等“挽救实验”和RNAi实验显示:miR-375直接通过调控PDGFC表达抑制肝癌新生血管生成;9.裸鼠成瘤实验结果显示:miR-375直接通过调控PDGFC表达抑制肿瘤生长、减少肿瘤血管的生成,明显延长裸鼠的生存时间;10.qRT-PCR、Western blottng结果提示:索拉非尼通过诱导miR-375表达上调抑制PDGFC表达;第三部分、miR-375调控肝癌细胞PDGFC下游信号通路的初步研究Western blotting结果提示:过表达miR-375明显抑制AKT、ERK1/2磷酸化;下调表达miR-375明显促进AKT、ERK1/2磷酸化;结论:1.索拉非尼浓度依赖性诱导肝癌细胞miR-375上调表达。2.miR-375通过抑制PDGFC的表达抑制肝癌新生血管的生成。3.索拉非尼通过诱导miR-375表达上调抑制PDGFC的表达。4.miR-375抑制PDGFC下游信号通路Akt,ERK1/2的磷酸化激活。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.7

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本文编号：1587617