肿瘤细胞来源的微颗粒携带溶瘤腺病毒杀伤肿瘤细胞初步探讨

发布时间：2018-03-09 17:02

  本文选题：微颗粒　切入点：溶瘤腺病毒　出处：《北京协和医学院》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：溶瘤病毒是一种经过基因改造的病毒,可以特异性地在肿瘤细胞中大量复制并杀伤肿瘤细胞。利用溶瘤病毒治疗恶性肿瘤是肿瘤生物疗法的主要策略之一,目前已有多种病毒被改造成溶瘤病毒,并得到快速发展。然而,溶瘤病毒具有很强的免疫原性,容易被机体的免疫监视系统识别并中和,导致溶瘤病毒难以到达肿瘤部位杀伤肿瘤细胞。但现有的一些溶瘤病毒载体,比如具有趋瘤性的细胞或人工合成的纳米材料,其效果并不理想,一些载体还存在着安全隐患。因此,亟待研发新型载体携带溶瘤病毒并靶向肿瘤细胞。我们课题组前期工作显示肿瘤细胞来源的微颗粒(Tumor cell-derived microparticles, T-MPs) (直径为100-1000 nm)可以包裹化疗药物并有效杀伤肿瘤细胞。而T-MPs是否能够包裹溶瘤腺病毒,作为运输溶瘤腺病毒的新型载体则不清楚。因此,我们提出假设：T-MPs的直径明显大于溶瘤腺病毒的直径(90～100nm),有可能成为包裹并运输溶瘤腺病毒的载体。为验证这一设想,本课题着重从以下三个方面进行研究：首先,检测T-MPs是否能够包裹溶瘤腺病毒。选用人肺癌细胞A549细胞提取包裹溶瘤腺病毒的微颗粒OA-MPs (Oncolytic adenovirus contained microparticles, OA-MPs);利用透射电子显微镜分析单个OA-MP的形态,以粒径分布分析技术和流式分析技术检测OA-MPs群体的直径分布状况,由此证实所提取的OA-MPs样本符合微颗粒的质量要求；再用PCR (Polymerase chain reaction, PCR)分析OA-MPs的成分,并采用双光子显微镜技术对T-MPs与溶瘤腺病毒进行共定位分析。结果证明OA-MPs可以包裹溶瘤腺病毒。其次,清除OA-MPs中游离的溶瘤腺病毒颗粒,对OA-MPs进行纯化后用于体外和体内实验,检测DA-MPS是否能有效杀伤肿瘤细胞。对于体外实验,将OA-MPs与多种肿瘤细胞共同培养,观察肿瘤细胞生长变化情况,结果发现：与对照组相比,OA-MPs组的肿瘤细胞凋亡增多；对于体内实验,通过建立裸鼠皮下、腹腔肿瘤模型,观察并比较对照组、溶瘤腺病毒组以及OA-MPs组的肿瘤大小、肿瘤重量及小鼠长期存活率。结果显示,与对照组和溶瘤腺病毒组相比,OA-MPs组的小鼠长期存活率明显提高,其肿瘤生长受到明显抑制。最后,为进一步验证T-MPs是否可以躲避中和抗体,作为携带溶瘤腺病毒的有效载体,本课题通过PCR技术、流式检测技术、电子显微镜技术、双光子显微镜检测技术、三维纤维蛋白软凝胶筛选干细胞技术,并建立动物皮下肿瘤以及腹腔肿瘤模型,对OA-MPs组与溶瘤腺病毒组杀伤肿瘤细胞的效果进行比较分析。结果发现：与空白对照组及溶瘤腺病毒组相比,OA-MPs杀伤肿瘤细胞具有以下特点：(1)OA-MPs可保护溶瘤腺病毒不被特异性中和抗体识别,并使溶瘤腺病毒有效杀伤肿瘤细胞；(2)OA-MPs可以介导其包裹的溶瘤腺病毒更快进入细胞核,使溶瘤腺病毒更快杀伤肿瘤细胞；(3)OA-MPs不依赖柯萨奇病毒腺病毒受体(Coxsackievirus and adeno virus receptor, CAR)介导溶瘤腺病毒进入细胞,因此对于CAR表达下调的肿瘤细胞依然具有杀伤作用；(4)OA-MPs能有效地抑制三维纤维蛋白软凝胶筛选出来的干细胞样肿瘤细胞的生长(Stem-like tumor-repopulating cells, TRC)。本研究利用T-MPs作为携带溶瘤腺病毒的载体,并通过体内外实验检测了T-MPs携带溶瘤腺病毒杀伤肿瘤细胞的特点与优势,为其潜在的临床应用提供了理论基础。
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【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.5
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本文编号：1589435