人类非小细胞肺癌细胞对小鼠体外血脑屏障模型功能及脑微血管内皮细胞epsinl、ZO-1表达的影响

发布时间：2018-03-09 17:44

本文选题：血脑屏障模型　切入点：小鼠　出处：《昆明医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分人类非小细胞肺癌细胞对小鼠体外血脑屏障模型功能的影响[目的]建立体外血脑屏障模型 (blood-brain barrier model, BBBM),观察非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC) A549细胞对其功能的影响。[方法]早上将周细胞(pericytes, PC)接种到Transwell膜下表面,星形胶质细胞(astrocytes, AS)接种到12孔板内,8h后将Transwell置入12孔板内,再将小鼠脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,BMEC)接种到transwell膜上表面,建立血脑屏障模型。模型建立后每天进行试漏试验及跨内皮电阻(transendothelial electrical resistance,TEER)测定,鉴定是否成模。成模后分为对照组与实验组,将A549细胞接种到实验组BBBM内室,共培养体系置于培养箱,分别于24h、48h、72h后进行电阻测定及辣根过氧化物酶渗透试验,以评估BBBM的功能。分别于渗透试验进行至2小时、6小时时取样,根据样本中辣根过氧化酶浓度计算表观渗透系数(apparent permeability coefficient,Papp)。[结果]1.部分血脑屏障模型在建立后3天成模,4天可全部成模。2. A549细胞加入BBBM内室共培养,(1)实验组TEER值与对照组比较:1天后无显著变化(p0.05) ; 2天后降低出现统计学差异(p0.05) ; 3天后降低具有显著统计学差异(p0. 01) ; (2)渗透试验与对照组比较:1天后,2h及6h渗透试验实验组Papp均降低,但无统计学差异(p0.05) ; 2天后实验组Papp升高,2h渗透试验差异具有统计学意义(p0.05) ,6h渗透试验差异无统计学意义(p0.05) ; 3天后实验组Papp升高,2h及6h渗透试验均具有显著统计学差异(p0. 01)。[结论]小鼠体外血脑屏障模型的功能可被人类非小细胞肺癌细胞影响。体外共培养体系可用于研究肺癌脑转移过程中肿瘤细胞与脑微血管内皮细胞间相互作用的分子机制。第二部分人类非小细胞肺癌细胞对小鼠脑微血管内皮细胞epsin1、ZO-1表达的影响[目的] :观察A549人类非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞对 bEnd.3 小鼠脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,BMEC)epsin1及zo-1表达的影响。[方法]:将小鼠脑微血管内皮细胞接种到75cm2斜颈培养瓶,培养4天,BMEC融合为单层并充分形成紧密连接后,随机分为bEnd.3 单独培养组、bEnd.3+人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial cell,HBEC)共培养组、bEnd.3+A549 共培养组,bEnd.3+HBEC 共培养组、bEnd.3+A549共培养组分别加入HBEC和人类非小细胞肺癌细胞(A549细胞)进行共培养,共培养48h后,以抗小鼠内皮细胞选择性粘附分子(endothelial cell-selective adhesion molecule,ESAM)作为分选抗体,采用流式细胞技术分选出bEnd.3,将分选出来的bEnd.3接种到12孔板内培养,动态观察细胞生长状况,分别于培养12h、36h及4d时DAPI染色计数单位面积(每400倍视野)内细胞数,评估细胞增殖速度;培养12h时进行epsin1免疫荧光染色观察epsin1表达情况及细胞形态、大小;培养4d时bEnd.3再次融合为单层后进行epsin1和ZO-1免疫荧光染色,观察epsin1和Z0-1表达情况。[结果]:1.在bEnd.3、HBEC、NSCLC这三种细胞中anti-mouse ESAM对bEnd.3具有特异性,作为抗体分选bEnd.3纯度bEnd.3+HBEC组平均为96.86%, bEnd.3+A549组平均为96.36%,两组间比较纯度无统计学差异。2. bEnd.3经共培养、分选后细胞活力好,细胞增殖速度bEnd.3单独培养组与bEnd.3+HBEC组比较无显著差异,bEnd.3+A549组经共培养及分选后细胞收缩变圆,与另外两组相比细胞增殖速度明显增快。3. epsin1表达bEnd.3单独培养组与bEnd.3+HBEC组比较无显著差异(P0.05 ),bEnd.3+A549组增强,与另外两组比较差异具有显著统计学意义(P0.01)。组内两个时间点进行比较,三组均有统计学差异,提示bEnd.3处于增殖状态时epsin1表达较功能状态时增强。4. Z0-1免疫荧光染色bEnd.3单独培养组和bEnd.3+HBEC组,荧光呈致密条带状位于相邻细胞间,互相连接形成网格状,而bEnd.3+A549组荧光条带疏松、增宽,并可见位于胞质内的荧光。[结论]:人类非小细胞肺癌细胞与小鼠BMEC共培养可使BMEC形态和分子表达发生变化,细胞收缩变圆,epsin1上调,ZO-1异位表达于细胞内,这些改变可能与NSCLC细胞侵袭穿透BBB及转移瘤血管生成相关。
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【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R734.2

【参考文献】