C-Raf激酶结合蛋白SMC3和PP2A Aα在肺癌发生中的机理研究

发布时间：2018-03-14 08:21

本文选题：肺癌　切入点：C-Raf　出处：《昆明理工大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：癌症是指起源于上皮组织的恶性肿瘤,而肺癌则是恶性肿瘤中最常见的一类,是全球死亡率和发病率最高的癌症,它给人们的生活和身体带来极大的威胁。因此研究肺癌的发病机制,寻找治疗肺癌的新靶点就显得更为迫切。Raf激酶(Rapidly Accelerated Fibrosarcoma)逆转录致癌病毒基因包括A-Raf、B-Raf和C-Raf三种亚型,Raf激酶的突变则是细胞癌变的主要原因之一,A-Raf突变可导致卵巢癌和大肠癌,B-Raf突变和神经系统癌变、皮肤癌和胸腺癌相关,C-Raf突变和小细胞肺癌相关,并且在肺癌组织中C-Raf蛋白的表达量明显增加,因此,调控C-Raf激酶及其结合蛋白也就成为了治疗肺癌的重要手段。然而大多数癌症治疗方法将注意力集中于单个靶点或单个突变,缺乏从系统的高度对动态的细胞信号网络的认识和对其内在机制的深入了解。在本研究中,我们以C-Raf的中心蛋白相互作用网络入手,深入调查了肿瘤细胞信号网络的关键节点在肿瘤发生中的作用。我们利用蛋白互组,高通量质谱分析技术系统性识别了 C-Raf的相互作用蛋白SMC3(Structural maintenance of chromosomes protein 3)染色体结构维持蛋白 3 和 PP2A Aα(protein phyosphatase2A Aα)蛋白磷酸酶 2A Aα。SMC3是黏连蛋白重要组成部分,SMC3和SMC1A亚基通过其铰链结构域二聚化形成'V'形状,这个'V'与底部的RAD21亚基连接形成一个封闭的三边环状结构,这个环状结构能够包围姐妹染色体从而介导姐妹染色体粘连蛋白的粘附,并在基因调控中发挥关键作用,SMC3在S期可以被乙酰化,建立染色质加载的粘连蛋白的粘着性,从而影响着细胞的周期。蛋白磷酸酶PP2A Aα是蛋白磷酸酶PP2A(protein phyosphatase2A,PP2A)的重要组成部分之一。PP2A是丝氨酸苏氨酸型的蛋白磷酸酶,在大多数的组织和细胞中的含量都非常高,它参与着DNA的复制、基因的转录、细胞的分化和凋亡、癌基因的转化等一系列的细胞生物学活动,除此之外它还与肿瘤的发生和发展具有一定的关系,PP2A Aα蛋白的突变与肺癌、子宫癌的发生有紧密的联系。我们分别构建了 SMC3和PP2A Aα蛋白的高表达质粒(pcDNA3.1-SMC3/PP2A Aα),敲减质粒(pSUPER-SMC3/PP2A Aα)以及敲除质粒(px459-SMC3/PP2A Aα),并稳转入到非小细胞肺癌A549细胞中,成功的构建了 SMC3/PP2AAα的高表达和敲减稳定细胞株。最后,我们通过CCK8法检测稳转pSUPER-SMC3后对A549细胞的增殖情况,发现稳转pSUPER-SMC3的A549细胞的增殖能力与对照组(control)和阴性实验组(pSUPER)相比明显下降,差异具有显著性意义(P0.01),证明PSUPER-SMC3的稳转抑制A549细胞的增殖;利用划痕和Transwell小室实验检测稳转pSUPER-SMC3后对A549细胞迁移的情况,实验组(PSUPER-SMC3)细胞数明显少于空白对照组和阴性对照组的细胞数目,差异具有显著性意义(P0.05),这就证明下调SMC3蛋白的表达确实会抑制A549细胞的迁移;用细胞成球实验检测细胞的成球能力和干性发现实验组的细胞成球数为(19.667±3.055)明显少于空白对照组(54.333±4.041)和阴性对照组(54.667±3.786),差异具有显著性意义(P0.05),而空白对照组和阴性对照组细胞成球数无显著性意义(P0.05),证明了下调SMC3蛋白的表达使A549细胞成球数减少,干性减弱。总而言之,我们挑选和确定了 C-Raf的结合蛋白SMC3和PP2AAα,并成功构建了SMC3和PP2A Aα的高表达、敲减和敲除质粒,随后稳转入A549细胞中,成功构建了 SMC3和PP2A Aα的高表达细胞株和敲减细胞株。其次证明了 SMC3的沉默会抑制A549细胞的增殖、迁移和成球能力,减弱细胞的干性,这些均是癌细胞生存和肿瘤发展的重要生物学功能,因此SMC3有望成为肺癌诊断的新的生物标志和治疗的药物靶点。
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【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R734.2

【参考文献】