ebv-miR-BART6-5p对EBV相关淋巴瘤细胞增殖和凋亡影响的研究

发布时间：2018-03-14 09:00

  本文选题：EBV相关淋巴瘤　切入点：表达谱芯片　出处：《广西医科大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分EBV mi RNA在EBV相关淋巴瘤中的生物信息学分析目的挖掘Gene Expression Omnibus(GEO)数据库中潜在的与EBV相关淋巴瘤有关的EBV mi RNA及其靶基因并进行验证。方法在GEO数据库中根据纳入标准筛选并下载EBV相关淋巴瘤的mi RNA表达谱芯片数据集GSE52916和m RNA表达谱芯片数据集GSE38885,运用GEO2R在线分析工具进行差异表达EBV mi RNA和m RNA筛选,利用生物信息学相关软件工具进行生物学功能注释、通路富集、EBV mi RNA-m RNA互作分析,对EBV mi RNA在EBV相关淋巴瘤中的作用进行综合评估。最后通过实时荧光定量PCR对筛选得到的EBV mi RNA在EBV阳性细胞Raji、Daudi、Farage和EBV阴性细胞Ramos、Pfeiffer中进行验证。结果在GEO数据库中获得了符合纳入标准的mi RNA和m RNA表达谱芯片数据集各一组,筛选得到18个在EBV阳性淋巴瘤中表达上调的EBV mi RNA和38个既是生物信息学软件预测出的EBV mi RNA的靶基因也是在EBV阳性淋巴瘤中下调的m RNA;对预测出的18个EBV mi RNA的靶基因富集获得了Wnt信号通路、MAPK信号通路等多个与淋巴瘤发生和进展有关的信号通路;生物学功能注释发现这些EBV mi RNA的靶基因参与了淋巴细胞分化、转录调节等生物学过程;EBV mi RNA-m RNA互作分析显示筛选得到的18个EBV mi RNA和38个m RNA中形成68对调控关系,其中ebv-BART11-5p、ebv-BART14-3p、ebv-BART1-3p、ebv-BART6-5p、ebv-BART17-5p、ebv-BART11-3p六个EBV mi RNA调控了68对中的37对,占54%。经过实时荧光定量PCR对筛选出的EBV mi RNA进行表达差异检测,最终ebv-mi R-BART1-5p、ebv-mi R-BART1-3p、ebv-mi RBART5-5p、ebv-mi R-BART6-5p、ebv-mi R-BART6-3p、ebv-mi RBART9、ebv-mi R-BART14-3p、ebv-mi R-BART15、ebv-mi RBART16、ebv-mi R-BART17-5p、ebv-mi R-BART17-3p这11个EBV mi RNA经验证表达趋势与芯片结果一致。结论通过对芯片数据的挖掘,利用生物信息学软件分析,可以获得在EBV阳性淋巴瘤中表达上调的EBV mi RNA及其潜在的靶基因,可有效指导下步分子生物学实验。其中ebv-mi R-BART6-5p在EBV阳性和阴性细胞中的表达差异倍数较大,并且在EBV mi RNA-m RNA网络调控中处于重要位置,可进一步探讨其生物学功能及作用机制。第二部分ebv-mi R-BART6-5p对EBV相关淋巴瘤细胞增殖和凋亡影响的研究目的通过体外分子生物学实验探讨ebv-mi R-BART6-5p对EBV相关淋巴瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法电穿孔法转染ebv-mi R-BART6-5p沉默和过表达质粒构建表达下调和过表达的细胞模型;利用慢病毒表达载体构建稳定下调ebv-mi R-BART6-5p的EBV阳性淋巴瘤细胞模型,实时荧光定量PCR检测ebv-mi R-BART6-5p的表达水平;CCK8法测定细胞生长曲线;流式细胞术检测细胞凋亡;Western Blot检测转染后细胞Akt、Bax、NF-κB p65、Iκκβ蛋白的表达量。结果通过电穿孔法构建ebv-mi R-BART6-5p表达下调细胞模型BART6-5p inhibitor/Farage和过表达细胞模型BART6-5p mimics/Pfeiffer,实时荧光定量PCR检测ebv-mi R-BART6-5p的表达量,BART6-5p inhibitor/Farage组低于mi R-sh NC/Farage组和Farage组,BART6-5p mimics/Pfeiffer组高于mi R-sh NC/Pfeiffer组和Pfeiffer组,P0.05;CCK8法检测细胞生长曲线结果示BART6-5p inhibitor/Farage组细胞增殖力低于mi R-sh NC/Farage组和Farage组,P0.05,BART6-5p mimics/Pfeiffer组细胞增殖力低于Pfeiffer组细胞,P0.05,BART6-5p mimics/Pfeiffer组细胞增殖力与mi R-sh NC/Pfeiffer组细胞的差异无统计学意义,P0.05;流式细胞术检测细胞凋亡结果显示BART6-5p inhibitor/Farage组细胞凋亡率高于Farage组细胞,P0.05,BART6-5p inhibitor/Farage组细胞凋亡率高于mi R-sh NC/Farage组细胞,但差异无统计学意义,P0.05,BART6-5p mimics/Pfeiffer组细胞凋亡率高于Pfeiffer组细胞,P0.05,BART6-5p mimics/Pfeiffer组细胞凋亡低于mi Rsh NC/Pfeiffer组细胞,差异无统计学意义,P0.05。利用慢病毒载体成功构建了ebv-mi R-BART6-5p稳定下调的GV-BART6-5p down/Farage细胞模型,实时荧光定量PCR检测ebv-mi R-BART6-5p的表达量明显低于于未转染的Farage细胞和转染阴性对照病毒的NC/Farage细胞,P0.05;CCK8测细胞生长曲线结果显示GV-BART6-5p down/Farage组细胞增殖能力明显低于Farage和NC/Farage组细胞,差异具有统计学意义,P0.05;流式细胞术检测三组细胞的凋亡率发现GV-BART6-5p down/Farage组细胞的凋亡率高于Farage和NC/Farage组细胞,差异具有统计学意义,P0.05;Western Blot检测GV-BART6-5p down/Farage组细胞中Akt、NF-κB p65、Iκκβ蛋白的表达量较Farage和NC/Farage组细胞下调,差异具有统计学意义,P0.05,Bax蛋白表达量较Farage组细胞上调,差异具有统计学意义,P0.05,较NC/Farage组细胞表达量上调,但差异无统计学意义,P0.05。结论ebv-mi R-BART6-5p有促进淋巴瘤细胞增殖,抑制细胞凋亡的可能,可以上调细胞PI3K/Akt、NF-κB信号通路的活性,抑制凋亡诱导蛋白Bax的表达。第三部分ebv-mi R-BART6-5p的靶基因验证目的前期体外生物学实验发现改变EBV阳性淋巴瘤细胞Farage的ebvmi R-BART6-5p表达可以影响淋巴瘤细胞的增殖和凋亡,本部分对ebvmi R-BART6-5p的靶基因及其结合位点进行验证。方法利用生物信息学方法预测靶基因,Western Blot技术检测GV-BART6-5p down/Farage、NC/Farage和Farage三组细胞中靶蛋白表达量,最后通过双荧光素酶报告基因检测系统验证靶基因的结合位点。结果运用生物信息学软件预测同时结合EBV mi RNA-m RNA互作图,选择DICER1作为候选靶基因进行验证。Western Blot检测三组细胞中DICER1蛋白表达量发现GV-BART6-5p down/Farage组细胞中DICER1蛋白相对表达量高于NC/Farage和Farage两组细胞,差异有统计学意义,P0.05;双荧光素酶报告基因检测显示DICER1为ebv-mi R-BART6-5p调控的靶基因。结论ebv-mi R-BART6-5p可以靶向作用于DICER1,DICER1是ebv-mi RBART6-5p调控的靶基因之一。
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【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.1
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本文编号：1610509