腺病毒介导的PTEN基因在皮肤T细胞淋巴瘤细胞株中的抗肿瘤作用及机制研究

发布时间：2018-03-15 11:11

本文选题：皮肤T细胞淋巴瘤　切入点：Hut78细胞　出处：《河北医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:通过研究腺病毒介导的PTEN基因在体外培养的皮肤T细胞淋巴瘤细胞株Hut78细胞中有无抑制其增殖及促进其凋亡的作用及其作用机制,以进一步探讨皮肤T细胞淋巴瘤的发病机制及PTEN基因在皮肤T细胞淋巴瘤中的抑制肿瘤细胞生长的作用机制,为开发皮肤T细胞淋巴瘤的新的治疗方法提供理论依据。方法:1研究对象:人皮肤T细胞淋巴瘤细胞株Hut78购于北京北纳创联生物技术研究院。人胚肾细胞株HEK293细胞由河北省四院肿瘤研究所保存,携带PTEN基因的腺病毒adenovirus-pten(ad-pten)及空白对照携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒空载体adenovirus-gfp(ad-gfp)质粒均购于加拿大Abm公司。2细胞的培养:人皮肤T细胞淋巴瘤细胞株Hut78细胞株培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中,48-72h传代1次,HEK293细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中,24-48h传代1次,置于37℃、5%CO_2饱和湿度的培养箱中培养,取对数生长期的细胞进行试验。3腺病毒的制备:携带PTEN、GFP基因的腺病毒质粒ad-pten、ad-gfp转染入HEK293细胞进行腺病毒的扩增、纯化、滴度测定。4腺病毒感染率的分析:荧光显微镜下观察携带绿色荧光蛋白的腺病毒ad-GFP感染Hut78细胞的效率。将对数生长期的Hut78细胞配成浓度为2×10~6/ml的单细胞悬液接种于六孔板(1ml/孔),以不同感染复数(MOI=1、10、50)的ad-GFP腺病毒感染细胞,培养24h、48h后分别于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况。5感染腺病毒后细胞形态学变化:光学显微镜下观察重组腺病毒ad-PTEN和ad-GFP分别以感染复数MOI=1、10、50感染Hut78细胞24h、48h后,细胞形态及生长状态变化。6感染腺病毒后细胞增殖抑制情况分析:CCK-8法测定不同感染复数、不同感染时间的腺病毒ad-PTEN,ad-GFP对Hut78细胞株增殖的抑制率。将对数生长期的Hut78细胞配成浓度为2×10~2/μl的单细胞悬液接种于96孔板中,每孔50μl,ad-PTEN,ad-GFP腺病毒以感染复数MOI=1、10、50感染细胞,每孔50μl,并设空白孔(不含细胞的培基)和对照孔(未做感染的细胞),感染24、48h后,每孔加入10μl CCK-8,于37℃、5%CO_2的培养箱中孵育1-4h,酶标仪测吸光度值(OD值),计算相应的增殖抑制率,并进行统计学分析,结果以均数±标准差的形式表示。7感染腺病毒后细胞凋亡情况分析:流式细胞术法测细胞凋亡率。将对数生长期的Hut78细胞配成浓度为5×10~6/ml的单细胞悬液接种于6孔板中,每孔1ml,设空白对照组及ad-PTEN(MOI=1、10)感染组,感染24h后行流式细胞术。8 PTEN及下游信号通路蛋白的表达:Western Blot法检测PTEN蛋白及其下游信号通路蛋白PI3k,Akt,Caspase-3的表达情况。将对数生长期的Hut78细胞以5×10~6/ml的浓度接种于6孔板中,每孔1ml,以不同感染复数(MOI=1、10、50)的ad-PTEN感染细胞,并设对照孔(未做感染的细胞孔),培养48h后提取细胞的总蛋白,行Western Blot。结果:1腺病毒制备结果:经过病毒的扩增,纯化,滴度测定,最终收获的病毒滴度均是1×10~9pfu/ml;2腺病毒的感染效率:荧光显微镜下观察重组腺病毒ad-GFP在Hut78细胞中的感染效率结果示感染效率随感染复数的增高及感染时间的延长而增高,感染效率50(MOI)10(MOI)1(MOI),48h24h;3感染腺病毒后细胞的形态学变化:光学显微镜下观察重组腺病毒ad-PTEN感染组的Hut78细胞随着感染复数增高及感染时间的延长,细胞内空泡、颗粒物的数量增多,部分细胞的核固缩、折光性变差,胞膜碎裂,细胞发生凋亡、死亡。而空白对照组及ad-GFP感染组细胞生长状态及形态未发生明显变化;4感染腺病毒后细胞增殖受抑制情况:导入PTEN基因后的Hut78细胞增殖受到抑制,抑制率随感染复数的增高及感染时间的延长而增高。均感染24h后ad-PTEN组(MOI=0、1、10、50)组抑制率分别为0,(35.87±12.95)%,(58.53±16.71)%,(73.04±5.07)%,P0.01,差异具有统计学意义。组内比较除MOI=10组与MOI=50组之间P值0.05,差异没有统计学意义之外,其余各组内P值均小于0.05,差异具有统计学意义。ad-GFP组(MOI=0、1、10、50)的抑制率分别为0、(4.83±0.84)%、(16.93±4.35)%、(21.87±5.72)%,P=0.39,差异没有统计学意义,且各组内相互比较P值均大于0.05,差异没有统计学意义。感染48h后ad-PTEN组(MOI=0、1、10、50)的增殖抑制率分别为0、(46.43±12.63)%、(64.28±13.40)%、(91.96±3.76)%,P0.01,差异具有统计学意义,组内相互比较除MOI=1与MOI=50组间P0.05,差异具有统计学意义,其余各组间差异均无统计学意义。ad-GFP组(MOI=0、1、10、50)的抑制率分别为0、(18.98±5.28)%、(22.11±8.39)%、(20.31±1.56)%,P=0.20,差异没有统计学意义,且各组内P值均大于0.05,差异没有统计学意义;5感染腺病毒后细胞的凋亡情况:在空白对照组、重组腺病毒ad-PTEN感染组(MOI=1、10),Hut78早期凋亡率分别为6.5%、12.8%、18.2%,随着感染复数的增高,细胞早期凋亡逐渐增多;6 PTEN及下游信号通路蛋白的表达:在空白对照组、重组腺病毒ad-PTEN(MOI=1、10、50)组PI3k、Akt蛋白表达逐渐减弱,在空白对照组、MOI=1、10组PTEN蛋白、Caspase-3凋亡蛋白表达逐渐增强,MOI=50组二者表达均较MOI=10组有所减弱。结论:1皮肤T细胞淋巴瘤细胞株可被腺病毒感染且感染效率随腺病毒感染复数的增加及感染时间的延长而增加。2腺病毒导入的PTEN基因产生正常的PTEN蛋白使皮肤T细胞淋巴瘤细胞发生明显的形态学变化,诱导了细胞凋亡。3腺病毒导入的PTEN基因产生的正常PTEN蛋白抑制了皮肤T细胞淋巴瘤细胞的生长增殖能力。4腺病毒导入的PTEN基因产生的正常PTEN蛋白促使皮肤T细胞淋巴瘤细胞的早期凋亡增多。5腺病毒导入的PTEN基因产生的正常PTEN蛋白抑制了皮肤T细胞淋巴瘤细胞中PI3k/Akt通路的磷酸化,从而促进了Caspase-3凋亡信号诱导细胞的凋亡,提示我们PTEN基因可能通过该通路发挥了诱导细胞凋亡的作用。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R739.5

【参考文献】