人肺腺癌顺铂耐药株通过富含miR-222-3p外泌体促进继发耐药形成

发布时间：2018-03-15 11:11

本文选题：A549细胞株　切入点：A549/DDP细胞株　出处：《河北医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:肺癌是目前世界上最常见的实体瘤之一,致死率高,顺铂作为临床治疗肺癌的基础化疗药,由此产生的耐药性是治疗无效的主要原因之一,故而迫切需要寻找新的治疗靶点以逆转或者降低耐药发生,进而降低副作用发生率,提高患者生存率。外泌体(exosome)作为细胞间传递信号的囊泡结构,近年来随着对其研究的深入,发现其在肿瘤发生、生长、侵袭、转移和耐药等方面发挥了举足轻重的作用。本实验通过研究人肺腺癌顺铂耐药株A549/DDP与野生株A549生物学行为,及耐药株外泌体对同源细胞A549顺铂耐受性的影响,寻找可能的分子耐药机制,从而获得可能的耐药靶点辅助治疗。方法:1人肺腺癌顺铂耐药株A549/DDP与野生株A549对顺铂的耐受性、细胞生长周期、细胞迁移特性的差异1.1购买人肺腺癌顺铂耐药株A549/DDP,并且继续诱导至其在顺铂(DDP)浓度2μg/ml中稳定增殖。通过MTS实验检测A549和A549/DDP细胞株对顺铂的IC50;用终浓度6μg/ml DDP处理A549细胞和A549/DDP细胞,PBS处理做对照,Annexin V-PE和7-AAD染色,流式细胞术检测细胞凋亡率,从以上两方面分析A549/DDP细胞株与A549细胞株对顺铂的耐受性差异。1.2通过PI染色流式细胞术检测细胞生长周期,Western Blot检测细胞蛋白p27表达变化,分析A549/DDP细胞株与A549细胞株细胞生长周期差异。1.3通过划痕实验、Transwell纵向迁移实验检测细胞迁移率;Western Blot检测细胞株EMT相关蛋白(N-Cadherin,E-Cadherin,Vimentin)表达,分析A549/DDP细胞株与A549细胞株迁移特性差异。2 A549/DDP细胞分泌的外泌体D-exo对同源细胞A549的顺铂耐受和迁移特性的影响2.1用含10%去外泌体胎牛血清(FBS)的1640培养基培养A549与A549/DDP细胞株72h,收集上清,经一系列差速离心后得到外泌体沉淀,沉淀用适量PBS溶解,测定蛋白含量以确定外泌体浓度,磷钨酸负染,电镜观察外泌体形态。2.2荧光染料Dil标记外泌体D-exo,与A549细胞株共培养过夜,观察A549对D-exo的摄取。2.3用PBS、A549分泌的外泌体A-exo和A549/DDP分泌的外泌体D-exo(终浓度均为50μg/ml)分别预刺激A549细胞株72h后,MTS法检测A549细胞株对顺铂的IC50;A549细胞株经如上刺激后,加入终浓度6μg/ml的DDP作用48h,Annexin V-PE和7-AAD染色,流式细胞术检测细胞凋亡率,分析D-exo对A549细胞株顺铂耐受的影响。2.4经2.3预刺激后,通过划痕实验、Transwell纵向迁移实验检测细胞迁移率,观察D-exo对A549细胞迁移能力的影响。3 D-exo中miRNAs可诱导A549细胞对顺铂的抵抗3.1 Real-time PCR检测细胞株miR-221-3p、miR-221-5p、miR-222-3p、miR-222-5p、miR-21-3p、miR-21-5p表达变化,筛选micro RNA研究对象。3.2 Real-time PCR检测细胞株A549和A549/DDP及相应外泌体A-exo、D-exo中miR-222-3p表达变化,比较其在外泌体与细胞的含量。3.3用PBS、A-exo和D-exo(终浓度均为50μg/ml)分别预刺激A549细胞株72 h后,Real-time PCR检测A549细胞株miR-222-3p表达变化。3.4 Western Blot检测A549和A549/DDP细胞株中miR-222-3p相关蛋白(PTEN,AKT,APE1)表达变化。用PBS、A-exo和D-exo(终浓度均为50μg/ml)分别预刺激A549细胞株72 h后,Western Blot检测A549细胞株中PTEN、AKT表达变化,分析D-exo对同源细胞相关蛋白表达的影响。结果:1 A549与A549/DDP细胞株对顺铂的耐受性、细胞生长周期、细胞迁移特性的差异1.1确立A549/DDP耐药株MTS法检测A549细胞株对顺铂的IC50为8.37±1.82(μg/ml),A549/DDP细胞株对顺铂的IC50为63.71±16.87(μg/ml),耐药指数为7.56±0.59,两株细胞对顺铂的IC50有统计学差异(P0.01)。细胞凋亡结果显示,A549细胞经PBS和6μg/ml DDP分别处理48h后,凋亡率分别为6.37%±1.67%和38.44%±3.99%;A549/DDP细胞经PBS,6μg/ml DDP分别处理48h后,凋亡率分别为6.84%±0.19%,20.86%±2.36%,A549细胞和A549/DDP细胞在6μg/ml DDP凋亡率有显著差异(P0.01)。1.2 A549/DDP细胞增殖明显减缓细胞周期结果显示,A549/DDP细胞的G0/G1期的细胞数显著高于A549细胞(P0.01),处于S期的细胞数显著低于A549细胞(P0.01),G2/M期的细胞数高于A549细胞(P0.05)。A549/DDP增殖明显减缓。Western Blot结果显示A549/DDP细胞周期抑制蛋白P27较A549细胞明显升高(P0.01)。1.3 A549/DDP细胞迁移能力增强划痕实验结果显示,A549和A549/DDP细胞的迁移率分别为23.34%±6.86%和44.44%±6.41%,两者差异有统计学意义(P0.05)。Transwell细胞迁移实验结果显示,迁移细胞经结晶紫染色后计数,A549细胞和A549/DDP细胞分别为26±7和198±22,差异有统计学意义(P0.01);染色细胞用冰乙酸抽提测吸光度结果显示,A549细胞和A549/DDP细胞的吸光度分别是0.35±0.24和1.42±0.14,差异有统计学意义(P0.01)。Western Blot结果表明,和A549细胞比较,A549/DDP细胞蛋白中神经型钙黏蛋白N-cadherin升高(P0.05),而上皮性钙黏蛋白E-cadherin和波形蛋白Vimentin改变无统计学差异。2 A549/DDP细胞分泌的外泌体D-exo对同源细胞A549的顺铂耐受、和迁移特性的影响2.1外泌体提取与鉴定利用差速离心方法得到A549细胞和A549/DDP细胞分泌的外泌体A-exo和D-exo,通过磷钨酸负染在透射电子显微镜下观察到大量散在的直径约在40-100nm的椭圆形囊泡。2.2 A549细胞摄取外泌体将A549细胞与Dil荧光染料标记的A549/DDP细胞分泌的外泌体D-exo共培养过夜,荧光显微镜下观察到细胞内存在大量红色荧光,呈丝网状。2.3 D-exo可增强A549细胞顺铂的耐药性A549细胞分别经PBS、A-exo、D-exo预刺激72h后,再加入6μg/ml顺铂处理48h,MTS检测结果显示,A549细胞对顺铂的IC50分别为8.37±1.82(μg/ml)、14.44±1.14(μg/ml)和39.44±8.46(μg/ml)。A-exo、D-exo均可显著提高A549细胞对顺铂的耐受性(P0.05和P0.01),且D-exo提高A549细胞对顺铂的耐受性更明显(P0.01)。细胞凋亡结果显示,A549分别与PBS、A-exo、D-exo共培养,在顺铂浓度6μg/ml时,凋亡率分别为48.44%±2.26%、40.58%±2.32%、28.06%±1.84%。与PBS和A-exo相比,D-exo可明显增加A549对顺铂的抵抗(P0.05)。2.4 D-exo可促进A549细胞迁移细胞划痕实验结果显示,PBS、A-exo、D-exo处理组A549细胞迁移率分别是25.68%±10.74%、33.57%±3.28%和55.0%±1.69%,与PBS和A-exo处理组相比,D-exo处理组A549细胞的迁移率明显提高(P0.01)。Transwell实验结果显示,结晶紫染色A549迁移细胞并计数,PBS、A-exo、D-exo处理组分别是27±8、67±14和139±13。经冰乙酸抽提后吸光度值在PBS、A-exo、D-exo处理组分别是0.35±0.24、0.81±0.07和1.19±0.08,与PBS处理组相比,A-exo和D-exo处理组A549细胞迁移率均明显提高(P0.05),且D-exo处理组比A-exo处理组促进作用更明显,差异有统计学意义(P0.05)。3 D-exo中可诱导A549/DDP细胞对顺铂的抵抗的miRNAs3.1 A549/DDP细胞的miR-222-3p表达显著上调实时荧光定量PCR结果显示,与A549细胞比较,A549/DDP细胞内miR-222-3p相对表达量明显增加,为10.79±1.72倍(P0.01),miR-221-3p、miR-221-5p、miR-21-5p相对表达水平也分别增加2.47±0.63、3.62±0.16、2.21±0.06倍,差异均有统计学意义(P0.05)。3.2 D-exo携带高水平的miR-222-3p实时荧光定量PCR结果显示,外泌体内miR-222-3p表达高于同源细胞表达量,A-exo和D-exo表达量分别为同源细胞的2.28±0.34和3.29±0.39倍(P0.05)。3.3 D-exo可通过传递miR-222-3p增加A549细胞对顺铂的耐受实时荧光定量PCR结果显示,D-exo预刺激A549后miR-222-3p表达上调,与PBS刺激组相比,A-exo和D-exo处理组miR-222-3p相对表达量分别为3.84±2.81(P0.05)和9.44±3.71倍(P0.01)。3.4 PTEN/AKT蛋白信号分子可能参与介导A549细胞对顺铂的抵抗作用Western Blot结果表明,和A549细胞比较,A549/DDP细胞中PTEN蛋白表达明显下调(P0.01),p-AKT1蛋白显著升高(P0.01),APE1蛋白无明显差异。与PBS组和A-exo组相比,D-exo预刺激A549细胞后,明显下调其PTEN蛋白表达(P0.01),进而促进p-AKT1的上调(P0.01)。结论:1 A549/DDP较A549细胞增殖减缓,迁移能力提高。2 A549/DDP细胞分泌的外泌体可促进A549细胞的迁移、降低A549细胞对顺铂的敏感性。3 A549/DDP细胞株高水平表达miR-222-3p,并通过释放富含miR-222-3p的外泌体促进A549细胞对顺铂的抵抗。4 PTEN/AKT相关信号分子可能参与了A549/DDP细胞分泌的外泌体诱导的A549细胞对顺铂耐受性增加。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R734.2

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