p38IP在肾癌细胞中的功能

发布时间：2018-03-15 16:57

  本文选题：肾细胞癌　切入点：p38IP　出处：《第二军医大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是成人泌尿系统常见的恶性肿瘤,在所有人类恶性肿瘤中,其所占比率约为2%-3%;在肾脏系统的恶性肿瘤中,其约占80-90%[1],肾细胞癌在我国泌尿系肿瘤中的发病率仅次于膀胱癌。肾细胞癌起源于肾脏实质的肾小管上皮,其生物学行为及其特征较为复杂,其发生发展的机制尚未完全明确,其具有较高的恶性程度,临床资料显示,25%-30%初次就诊即确诊肾细胞癌的患者已经发生转移[2]。对于那些初次诊断为局限性肾癌的患者,在进行根治性手术后的10年内仍有30%的转移风险。目前,外科手术是根治肾细胞癌的主要方法,但那些已经发生了转移的肾细胞癌患者,则无法接受根治性手术治疗。此外,对于中晚期肾癌患者,尽管随着近年来生物靶向治疗、免疫治疗等新的治疗手段的不断应用,能在某种程度上延长患者生存期,但大多数病人仍难免死于肿瘤复发及转移,其5年生存率往往小于10%[3]。因此,探索肾细胞癌发生、发展的分子机制,寻找有效的生物学标记物,仍然具有很强的现实意义,以期为肾细胞癌的生物治疗提供新的治疗思路。p38结合蛋白p38IP(p38-interacting protein)是被研究者发现的一种能直接与p38结合的蛋白,并且能够参与p38 MAP激酶的激活过程[4]。Uta Schmidt等[5]通过对61例前列腺癌及癌旁正常腺体标本进行qPCR检测,结果显示61例前列腺癌标本中中46%呈现p38IPmRNA低表达1.5倍以上,28%的标本例数呈现mRNA高表达1.5倍以上。p38IP可以通过通过与p38的相互作用,下调E-cadherin(钙黏蛋白)参与哺乳动物原肠胚的形成过程,并且p38IP与p38的这种相互作用是下调E-cadherin所必须的,否则将会导致原肠胚发育缺陷[3]。另有报道发现,细胞在饥饿条件下,p38IP可与自噬相关蛋白Atg9的相互作用,并参与Atg9所介导的信号通路和自噬体的形成[6]。有关p38IP的研究目前屈指可数,有关其与肿瘤关系的研究,目前更是鲜见报道。研究目的探寻p38IP在肾癌组织、肾癌细胞株中的表达;通过体内及体外实验研究p38IP在肾癌细胞株中的细胞生物学功能;探讨p38IP对肾癌细胞生物学作用的可能相关机制。方法通过免疫印记法及qPCR技术探寻p38IP在肾脏肿瘤、正常肾脏组织、正常肾小管上皮细胞株以及肾癌细胞株中mRNA水平和蛋白水平的表达。通过生长曲线、细胞划痕试验、平板克隆形成实验检测了稳定表达及干扰p38ip对肾癌细胞株生物学的影响。balb/c-nu裸鼠移植瘤模型,观察p38ip在体内实验中的生物学效应。采用饥饿方法诱导自噬,观察p38ip对肾癌细胞自噬活性的影响。分子机制的初步探讨:利用免疫印迹法研究p38ip对细胞周期蛋白以及pi3k/akt/mtor信号通路相关信号分子的影响,初步探讨p38ip调控细胞增殖能力及细胞自噬的可能分子机制。主要结果肾透明细胞癌组织p38ipmrna呈现低表达趋势,p38ip蛋白水平呈现高表达趋势。人正常肾小管上皮细胞株hk-2相比,肾透明细胞癌细胞株os-rc-2及786-omrna水平低表达;蛋白水平,os-rc-2细胞株表现为p38ip低表达,786-o细胞株为高表达。慢病毒成功构建稳定表达pbob-gfp及pbob-p38ip的os-rc-2细胞株。p38ip参与调控肾癌细胞增殖,稳定表达p38ip能够显著抑制os-rc-2细胞株的增殖能力,表现为生长曲线受到抑制,单细胞集落形成能力显著降低,细胞周期分布显示超表达p38ip后os-rc-2细胞株g2/m期阻滞。体内实验进一步证实在os-rc-2细胞株中超表达p38ip导致裸鼠移植瘤生长受到抑制,表现为瘤体生长显著减慢,最终收获的瘤体更小。但是在另外一株肾癌细胞株786-o中,应用sirna技术瞬时干扰p38ip的表达亦显著抑制该细胞株的生长曲线。western-blot检测显示,稳定表达p38ip后能够显著增强饥饿诱导的os-rc-2细胞自噬,在通过sirna干扰p38ip的表达则显著抑制786-o细胞自噬。在os-rc-2细胞株中超表达p38ip能加快cyclina的降解,但同时也延缓了cyclinb的降解速度,在os-rc-2细胞株中超表达p38ip反而检测到了p38的磷酸化水平异常增强,这可能是其延缓cyclinb降解的机制之一。而在786-o细胞株中应用sirna干扰p38ip能够显著减慢细胞周期蛋白cyclina及cyclinb的降解。p38ip参与调控pi3k/akt/pmtor信号通路,可能是其参与调控自噬的潜在机制。稳定表达p38ip的os-rc-2细胞株,其pi3k/akt/mtor信号通路受到抑制,表现为p85表达量降低,akt及mtor磷酸化水平降低,而在786-o细胞中干扰p38ip后pi3k/akt/mtor信号通路则激活。p38ip负性调控肾癌细胞株os-rc-2中pi3kc3蛋白含量,并且p38ip蛋白分别与pi3kc3和beclin1蛋白存在相互作用。主要结论1、p38ip在肾癌组织中呈现蛋白水平的高表达趋势和mrna水平的低表达趋势,在肾癌细胞株中蛋白水平表达不一致,mrna呈现低水平表达。2、p38ip参与调控肾癌细胞株增殖能力,超表达p38ip可以导致os-rc-2细胞细胞周期G2/M期阻滞,超表达p38IP可以促进肾癌细胞株OS-RC-2细胞株迁移;干扰p38IP抑制786-O增殖。3、p38IP通过调控细胞周期蛋白Cyclin A和Cyclin B的降解是其参与调节肾癌细胞株OS-RC-2及786-O增殖能力的潜在机制之一。4、p38IP负向调节肾癌细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路。5、p38IP促进由饥饿诱导的肾癌细胞OS-RC-2自噬,这种自噬调节具有mTOR依赖性。6、p38IP负向调控PI3KC3蛋白含量,并且p38IP与PI3KC3和Beclin1存在蛋白水平的相互作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.11

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本文编号：1616191