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IL-21对CIK细胞抗白血病系K562细胞活性作用及其机制的研究

发布时间:2018-03-16 02:02

  本文选题:IL-21 切入点:CIK细胞 出处:《兰州大学》2017年硕士论文 论文类型:学位论文


【摘要】:目的:观察IL-21对CIK细胞增殖、分泌、细胞亚群比例、细胞因子mRNA量表达的变化,探讨IL-21对CIK细胞抗白血病系K562细胞毒性作用及其机制的影响。方法:抽取健康志愿者肝素抗凝的外周全血30ml,用Ficoll溶液提取出外周血单个核细胞,将该细胞置于3个不同的无菌培养瓶中,随机设为对照组(加入IL-2 100ng/ml,无IL-21)、IL-21组(加IL-21,不加IL-2)、IL-21+IL-2组(加IL-21与IL-2),用含有10%FBS 1640培养基进行培养,每天在倒置相位差显微镜下观察细胞形态变化,第0、7、10、14d用手工计数法计数细胞数量及计算出总数量;第14d分别收取每组培养瓶中的悬液,离心,取上清液,用ELISA法测定上清中IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-10、TGF-β、IL-21量,收取细胞,用流式细胞术检测CIK细胞亚群CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+、CD25+、CD4+CD25+比例,用CCK-8检测CIK细胞对白血病系K562细胞的毒性作用,用实时荧光定量PCR法检测穿孔素、Granzyme A、Granzyme B、Fasl、NKG2D、IL-21R mRNA表达量的变化,用Western blot法检测CIK细胞JAK-STAT中STAT1、STAT5a、TAT3和STAT5b信号通路的变化。结果:CIK细胞培养至第5天开始,细胞体积略有增大,数量逐渐增多,第7、10d细胞数量明显增多,IL-21组、IL-21+IL-2组细胞数量变化较对照组无明显差异(P0.05),第14d细胞体积明显较大,数量显著增加,IL-21组细胞数量明显低于对照组,有统计学意义(P0.05),IL-21+IL-2组较对照组无明显差异,无统计学意义(P0.05);CIK细胞培养至第14天时,IL-21组、IL-21+IL-2组上清液中IFN-γ、TNF-α、IL-21量较对照组明显升高,有统计学意义(P0.05),IL-21组、IL-21+IL-2组IL-10量较对照组明显降低,有统计学意义(P0.05),IL-21组、IL-21+IL-2组较对照组IL-2、TGF-β量无明显变化,无统计学意义(P0.05);IL-21组、IL-21+IL-2组细胞亚群CD25+、CD3+CD4+、CD3+CD56+比例较对照组增加,有统计学意义(P0.05),IL-21组、IL-21+IL-2组CD3+CD8+、CD4+CD25+比例较对照组无明显变化,无统计学意义(P0.05);IL-21组、IL-21+IL-2组CIK细胞对K562细胞的毒性明较对照组明显增强,有统计学意义(P0.05);IL-21组、IL-21+IL-2组CIK细胞穿孔素、颗粒酶B、Fasl、IL-2R、IL-21R mRNA量表达较对照组明显升高,有统计学意义(P0.05),IL-21组、IL-21+IL-2组颗粒酶A、NKG2DmRNA量表达较对照组无明显变化,无统计学意义(P0.05);Western blot的结果显示,IL-21组、IL-21+IL-2组的STAT3和STAT5b表达较对照组明显升高,IL-21组、IL-21+IL-2组、对照组STAT1和STAT5a的表达无明显差异,此结果说明IL-21可以活化CIK细胞的STAT3和STAT5b信号通路。结论:IL-21诱导CIK细胞,无促进增殖的作用,但可增加CD25+、CD3+CD4+、CD3+CD56+亚群比例,促进分泌IFN-γ、TNF-α、IL-21,抑制分泌IL-10,促进细胞穿孔素、颗粒酶B、Fasl、IL-2R、IL-21R mRNA量表达,从而促进IL-21诱导CIK细胞对白血病系K562细胞的毒性作用,其机制之一是激活JAK-STAT中的STAT3、STAT5b细胞信号通路。
[Abstract]:Objective: to observe the effects of IL-21 on the proliferation, secretion, cell subgroup ratio and the expression of cytokine mRNA in CIK cells. To investigate the effect of IL-21 on the cytotoxicity of CIK cell line K562 and its mechanism. Methods: the peripheral blood 30 ml of heparin anticoagulant was extracted from healthy volunteers and the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were extracted with Ficoll solution. The cells were placed in three different aseptic culture flasks. The cells were randomly divided into control group (adding IL-2 100ng / ml, IL-21 + IL-21 + IL-21 + IL-21 + IL-21 + IL-21 + IL-21 and IL-2N), and cultured on the medium containing 10S1640. The cell morphology was observed under inverted phase difference microscope every day. On the 14th day, the cell number was counted by manual counting method and the total number was calculated. On the 14th day, the suspension from each culture bottle was collected, centrifuged, and supernatant was taken. The ELISA assay was used to determine the amount of IL-21 in the supernatant of IFN- 纬 -TNF- 伪 and IL-10 TGF- 尾 -tGF- 尾, and the percentage of CD4 / CD25 in CD3 CD4 CD3 CD8 CD3 CD56 CD25 / CD25 and CIK cells were detected by flow cytometry, and the toxicity of CIK cells to K562 cells was detected by CCK-8. Real time fluorescence quantitative PCR was used to detect the changes of IL-21R mRNA expression in CIK cells, and Western blot assay was used to detect the changes of STAT1, STAT5a, TAT3 and STAT5b signaling pathways in JAK-STAT. The number of cells in IL-21 IL-2 group was significantly increased on the 7th day (P 0.05), but the cell volume of IL-21 IL-2 group was significantly larger than that of the control group on the 14th day, and the number of IL-21 group was significantly lower than that of the control group, and the cell number of IL-21 group was significantly lower than that of the control group. There was no significant difference between the IL-2 group and the control group, and the content of IFN- 纬 -TNF- 伪 IL-21 in the supernatant of IL-21 IL-2 group was significantly higher than that in the control group at the 14th day, and the IL-10 content in the IL-21 IL-2 group was significantly lower than that in the control group. There was no significant change in the level of IL-21 IL-2 in IL-21 group compared with that in control group, and there was no significant difference in the percentage of CD3 CD4 CD3 CD56 in IL-21 IL-2 group compared with the control group, and there was no significant difference between P0.05 and IL-21 group in the percentage of CD25 CD3 CD4 and CD3 CD56 in IL-21 IL-2 group. The ratio of CD3 CD8 CD8 CD4 CD25 in IL-21 IL-2 group was not significantly different from that in control group, and the cytotoxicity of CIK cells to K562 cells in IL-21 IL-2 group was significantly higher than that in control group. Compared with the control group, the expression of IL-21R mRNA in the granzyme BsFasl1 + IL-2Rnr was significantly higher than that in the control group. There was no significant change in the expression of granzyme ANGG2D mRNA in the IL-21 IL-2 group compared with the control group, and the expression of IL-21R mRNA in the IL-21 IL-2 group was significantly higher than that in the control group. The expression of STAT3 and STAT5b in IL-21 IL-2 group was significantly higher than that in IL-21 IL-2 group, while the expression of STAT1 and STAT5a in IL-21 IL-2 group was not significantly higher than that in IL-21 IL-2 group. These results suggest that IL-21 can activate the STAT3 and STAT5b signaling pathways of CIK cells. Conclusion: IL-21 can induce the proliferation of CIK cells without promoting the proliferation of CIK cells, but it can increase the proportion of CD25 CD3 CD4 and CD3 CD56 subsets, promote the secretion of IFN- 纬 TNF- 伪 -IL-21, inhibit the secretion of IL-10, and promote the production of perforin. The expression of IL-2RnIL-21R mRNA in leukemic K562 cells induced by IL-21 could be enhanced by the activation of STAT3 / STAT5b signaling pathway in JAK-STAT.
【学位授予单位】:兰州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R733.7

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本文编号:1617812

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