NCOA5蛋白和SIRT1蛋白与食管鳞癌进展以及预后的相关性研究

发布时间：2018-03-17 16:32

本文选题：食管鳞状细胞癌　切入点：NCOA5　出处：《山东大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景及意义肿瘤因其极高的致死率,一直以来都是世界范围内人们关注的首要的健康问题。随着现代医学的发展,人们针对肿瘤的斗争已经持续了几十年。通过近几十年的斗争,虽然未能攻克肿瘤这一难题,但是,人们已经对其有了许多极其有益的认识,在研究与实践中总结出了恶性肿瘤的诸多特性,如自给自足的生长信号通路、不断地自我复制并逃避凋亡以及生长抑制信号的控制,诱导血管生成,激活侵袭转移机制向邻近组织以及远处播散等。从这些角度出发,有助于我们更好的研究各种不同的恶性肿瘤。食管鳞癌作为食管癌的一个重要亚型,恶性程度极高,且在我国有着极高的发病率。其旺盛的生长力导致肿瘤发展速度极快,大多数患者发现时已处肿瘤晚期。同时食管鳞癌还有着极强的侵袭性,极易向周围组织浸润,并通过淋巴途径向远处播散。这些都使得食管鳞癌的治疗变得极为棘手。目前为止,能够提高患者预后的主要方法依然是早期发现早期针对性的治疗。因此,如能通过对影响食管鳞癌进展及预后的分子生物学指标进行研究,发现一种非侵袭性的检查方法或者治疗靶点,筛查发现早期食管鳞癌患者,或者对术后预后较差的患者进行筛选,进行有针对性的治疗,将有极其重要的临床价值。NCOA5是一种独特的核受体共激活因子,能够特异性的与雌激素受体a(ERa)及雌激素受体p(ERβ)相结合。该共激活因子通过与受体的配体结合域(LBD)结合,调控核受体激活相应的目的基因,调节生殖、生长、发育等多种重要的信号转导过程。目前对其研究十分有限,主要集中在其与ERa的相互作用上。然而这已经显示出NCOA5在肿瘤进展中所发挥的重要作用。对NCOA5表达缺陷的小鼠进行研究,发现其肝脏中胰岛素受体β(IR-β)、胰岛素受体底物-1(IRS-1)以及蛋白激酶B(AKT)的磷酸化受到了严重的影响,同时有众多涉及到NF-κB、雄激素以及胰岛素通路的基因发生了表达量的变化。NCOA5通过对IL-6表达量的影响等多种途径促使了肝细胞癌的发生。因此,对NCOA5进行更深入的研究,可能有利于加深对包括食管鳞癌在内的其他恶性肿瘤进展机制的认识,为食管鳞癌的诊治提供新的靶点。SIRT1作为酵母菌沉默信息调节因子2(Sir2)在哺乳动物中的同源物,在进化过程中高度保守,是一种NAD+依赖的组蛋白去乙酰化酶,属于Ⅲ型组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)家族。SIRT1通过其多层次的调节作用,参与到诸如细胞代谢、长寿以及压力应激等多种重要的生物学过程之中。随着对该分子研究的深入,其在肿瘤发展中起到的作用越来越受到关注。虽然已经发现SIRT1在多种类型的肿瘤中存在过表达,而且能够通过去乙酰化作用抑制诸如p53、叉头(FOXO)转录因子家族在内的多种重要的肿瘤抑制因子诱导凋亡的能力,但是SIRT1在肿瘤发生发展中的作用仍然令人迷惑。如SIRT1被激动剂白藜芦醇激活后不仅没有起到促进肿瘤生长的效果,反而使某些肿瘤细胞的生长受到抑制。同时还发现,在部分肿瘤中,SIRT1的表达明显降低。最近有研究显示,SIRT1还能参与调控肿瘤中VEGF-C的表达,提示SIRT1可能参与肿瘤的微淋巴管生成。综上所诉,NCOA5及SIRT1在肿瘤进展及预后中发挥重要作用,然而他们与食管鳞癌的关系,国内外目前仍没有报道,于是我们将焦点对准其中,进行了以下三个部分的研究：第一部分,检测NCOA5在食管鳞癌患者肿瘤及邻近正常组织中的表达,探讨NCOA5表达与食管癌鳞癌患者各项临床病理特征以及预后的关系；第二部分,通过转染过表达NCOA5,研究NCOA5过表达对食管鳞癌细胞各种恶性生物学行为的影响；第三部分,通过检测SIRT1等指标在pN0期食管鳞癌患者中的表达,探究SIRT1与肿瘤微淋巴管生成、淋巴管浸润以及患者各临床特征间的关系,同时探讨SIRT1、肿瘤微淋巴管生成以及淋巴管浸润对该部分患者预后的影响。第一部分NCOA5蛋白低表达与食管鳞癌患者预后间的关系目的：探究NCOA5在食管鳞癌(ESCC)中的表达及其与食管鳞癌患者生存预后之间的关系。方法：应用免疫组织化学法检测NCOA5在119名食管鳞癌患者肿瘤组织中的表达。应用Western blot法检测十对新鲜的肿瘤及邻近正常组织中NCOA5的表达。应用统计分析分析其表达与各种临床指标之间的关系,以及对患者预后的影响。结果：通过免疫组织化学法检测发现,NCOA5表达与肿瘤分化程度(P=0.039),T分期(P=0.047)以及肿瘤分期(P=0.036)显著相关。此外,我们通过Western blot法检测发现NCOA5在正常组织中表达高于相应肿瘤组织中。单因素分析显示较差的分化程度(P=0.035,P=0.027),淋巴结转移(P0.001,P0.001),较高的T分期(P=0.010,P=0.012),较晚的肿瘤分期(P0.001,P0.001)以及NCOA5低表达(P0.001,P0.001)与不良的无病生存期(DFS)以及总生存期(OS)都显著相关。多因素分析显示NCOA5低表达(P=0.019,P=0.047),较高的T分期(P=0.015,P=0.012),淋巴结转移(P=0.040,P=0.021)以及较晚的肿瘤分期(P=0.017,P=0.046)都是较差DFS和OS预后的独立危险因素。结论：该研究显示NCOA5低表达与ESCC进展具有相关性,同时,NCOA5低表达还是预测ESCC患者较差预后的潜在性生物指标。对NCOA5进一步的研究有可能帮助找出新的、更加有效的针对ESCC的诊疗策略。第二部分NCOA5蛋白表达与食管鳞癌细胞恶性生物学行为的相关性研究目的：探究NCOA5在食管鳞癌细胞中的表达,并研究NCOA5过表达对食管鳞癌增殖、凋亡、迁移以及侵袭等恶性生物学行为的影响,明确NCOA5在食管鳞癌细胞中发挥的作用。方法：应用Western blot检测NCOA5在多种食管鳞癌细胞中的表达。通过转染pcDNA3.1-NCOA5促使细胞中过表达NCOA5,并进一步探究其对食管鳞癌细胞增殖的影响。应用流式细胞学技术,检测NCOA5过表达后食管鳞癌细胞凋亡情况,并应用Western blot检测Bcl-2、Bax表达量的变化。应用细胞划痕实验、Transwell小室迁移侵袭实验,以及Western blot检测E-cadherin表达量,探究NCOA5对食管鳞癌细胞迁移以及侵袭能力的影响。结果：NCOA5表达量在EC109、TE-13、TE-8三种细胞系中均较少。转染]pcDNA3.1-NCOA5后48h,Western blot检测到NCOA5蛋白表达量显著增高(P0.05)。MTT实验检测发现,过表达NCOA5的食管鳞癌细胞系EC109、TE-13增殖能力明显减弱(P0.05)。流式细胞学检测发现,EC109、TE-13在NCOA5表达上调之后,肿瘤细胞凋亡率均明显增高(P0.05),同时Bcl-2表达下降(P0.05),Bax表达增高(P0.05)。细胞划痕实验以及Transwell小室迁移侵袭实验发现,NCOA5过表达的食管鳞癌细胞,迁移和侵袭能力都被削弱(P0.05),并伴有E-cadherin表达量的升高(P0.05)。结论：NCOA5的表达对食管鳞癌增殖、凋亡、迁移以及侵袭等多种恶性生物学行为均有显著影响,NCOA5表达缺失可能是食管鳞癌疾病的进展中重要的一环,对NCOA5更加深入的研究将有助我们更好的了解该疾病,并将会对其治疗起到有益的作用。第三部分SIRT1蛋白表达与淋巴管生成、淋巴管侵袭及pN0期食管鳞状细胞癌患者预后间关系的研究目的：探究SIRT1在pN0期食管鳞状细胞癌中的表达,在淋巴管生成、淋巴管侵袭(LVI)中的作用以及对pN0期ESCC患者预后的影响。方法：共有206例患者被纳入到该回顾性研究中。应用免疫组织化学法测定SIRT1以及VEGF-C的表达。癌旁微淋巴管密度(LVD)以及LVI应用免疫组织化学法染色D2-40来进行标记、评估。应用相关统计学方法来探究SIRT1表达与各种临床病理学特征之间的关系以及SIRT1对肿瘤诱导的微淋巴管生成、LVI以及ESCC患者预后的影响。结果：SIRT1被发现主要表达于细胞核中。SIRT1在95例患者肿瘤标本中呈现高表达并与T分期(P0.001),肿瘤分期(P=0.001),VEGF-C阳性表达(P=0.015),高LVD(P=0.013)以及阳性LVI(P=0.015)显著相关。肿瘤组织标本中SIRT1高表达,高LVD以及LVI阳性的患者五年无病生存期(P0.001,P=0.030,P0.001)以及总生存期(P0.001,P=0.017,P0.001)较差,结果具有统计学意义。然而,通过多因素Cox回归分析,只有SIRT1高表达以及LVI阳性是影响患者五年无病生存期(P=0.029,0.018)以及总生存期(P=0.045,0.031)的独立危险因素。结论：SIRT1高表达与肿瘤的发展、微淋巴管生成、LVI以及pN0期ESCC患者较差的预后间显著相关。我们的研究显示了SIRT1在预测患者不良预后方面的价值,并且提供了一种潜在的新的治疗ESCC的靶点。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.1

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