负性共刺激分子B7-H4在结直肠癌中表达的临床意义及其调控机制

发布时间：2018-03-17 17:30

  本文选题：结直肠癌　切入点：B7-H4　出处：《苏州大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：结直肠癌是常见的十大恶性肿瘤之一,已成为世界男性第三位、女性第二位高发的恶性肿瘤。虽然常规的临床治疗手段如手术、放疗和化疗等使患者生存率得到了一定程度的提高,但晚期患者的治疗效果仍不理想。因此,进一步探讨肿瘤免疫调控的机制,寻找新的干预靶点,业已成为领域重要课题。肿瘤微环境在肿瘤发生发展中有着极为重要的作用,肿瘤细胞通过其表面表达的分子与周围细胞及细胞因子相互作用,相互影响,逃避机体免疫监视,以形成肿瘤免疫逃逸、促进肿瘤细胞生长及转移。而负性B7家族共刺激分子B7-H4是肿瘤微环境及介导肿瘤免疫逃逸的重要免疫卡控点分子。业已表明,B7-H4可通过抑制T细胞的增殖、细胞因子的产生和细胞周期负性调控T细胞的免疫应答,促进肿瘤细胞增殖与转移。临床研究表明,B7-H4可以组成性表达于多种肿瘤组织,与疾病的不良预后密切相关。已有研究主要集中在B7-H4在肿瘤组织中的异常表达、临床意义以及其负性作用上,但B7-H4分子在肿瘤在组织中异常表达的调控机制尚不清楚。蛋白激酶C(PKC)是一类广泛分布于哺乳动物组织细胞中的丝/苏氨酸蛋白激酶,在细胞信号转导、细胞增殖调控以及肿瘤的发生中起重要作用。PKC是结肠细胞生长与分化的重要调节器,化学致癌模型已广泛被用于解释信号异常,而这种异常会引起结直肠恶性变。鉴于PKC信号在调控细胞表达中发挥了重要作用,本研究以PKC信号可能参与调节结直肠癌中B7-H4表达切入,进一步探讨结直肠癌中B7-H4异常表达的临床意义及PKC对其可能的调节机制。第一部分PKC信号对结直肠癌细胞B7-H4表达的调节作用【目的】检测佛波酯(TPA)及PD98059对结直肠癌细胞株B7-H4基因及蛋白表达的影响,初步探讨PKC信号对结直肠癌细胞B7-H4异常表达可能的调节作用。【方法】本研究收集11例新鲜结直肠癌组织、5例炎性息肉及6例癌旁正常组织,半定量-PCR及免疫组化检测不同肠组织中B7-H4表达水平。应用TPA诱导HCT116及SW480细胞,利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和流式细胞分选试验(FCM)检测处理组与对照组细胞B7-H4基因及蛋白水平变化,观察它们在TPA不同浓度及不同时相作用下B7-H4m RNA水平变化、细胞膜表面及胞浆内B7-H4蛋白表达的变化。PKC下游信号阻断剂PD98059作用于HCT116细胞后,PCR法和FCM检测细胞中B7-H4的表达变化。【结果】RT-PCR法检测肠组织中B7-H4 m RNA表达水平,结果显示11例结直肠癌组织中有7例癌组织B7-H4表达水平明显增高,而在6例癌旁组织和5例肠息肉中仅发现1例表达水平增高。RT-PCR结果发现TPA(50、100ng/ml)处理后,100ng/ml的TPA可以使B7-H4 m RNA表达上调较为明显。100ng/ml的TPA分别作用于结直肠癌细胞24、48、72小时后,流式分析结果显示,HCT116细胞在作用48小时后B7-H4蛋白表达上调最为明显,SW480细胞在作用72小时后B7-H4蛋白表达上调最为明显。TPA作用48小时后,免疫荧光染色结果同样显示,TPA可促进HCT116细胞B7-H4蛋白表达上调;而PCR法及FCM检测结果显示,在PD98059作用后,HCT116细胞中B7-H4基因及蛋白表达下调。【结论】结直肠癌组织中B7-H4存在基因及蛋白水平的上调表达,提示结直肠癌组织中其表达可能受到了转录水平的调控,PKC信号的活化可能参与了结直肠癌细胞B7-H4的表达调节。第二部分B7-H4及PKC-δ在结直肠癌中的表达相关性及其临床意义【目的】检测PKC-δ及B7-H4分子在结直肠癌组织中的表达,确定两者的表达是否存在相关性,分析其表达与结直肠癌临床病理参数之间的关系。【方法】收集87例初诊的结直肠癌标本及15例癌旁组织,通过病理芯片、免疫组化染色技术、免疫荧光双染等方法检测B7-H4和PKC-δ在肿瘤组织的表达及其相关性,并通过统计学分析其临床表达意义。【结果】免疫组化结果显示,在87例结直肠癌患者中,B7-H4表达阳性率为63.2%(55/87);PKC-δ表达阳性率为65.5%(57/87);其中结直肠癌细胞膜上存在PKC-δ明显阳性表达的为40.2%(35/87)。B7-H4的异常表达与肿瘤浸润深度有关(P0.05);PKC-δ的异常表达与肿瘤的淋巴结转移有关(P0.05);而PKC-δ的膜表达与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移及Ducks临床分期等多项临床参数均有显著差异(P0.05),更能反映结直肠癌的进展。免疫组化及荧光双染结果显示,结直肠癌组织上存在PKC-δ与B7-H4共表达,且两者表达具有显著相关性(r=0.606,P0.01),其中膜表达PKC-δ的标本有34例(34/35)存在B7-H4的强阳性表达。【结论】本研究发现PKC-δ与B7-H4在结直肠癌细胞的表达显著正相关,且PKC-δ膜表达的增强与疾病恶性程度有显著性意义;进一步推测该酶活化的信号途径可能参与调控了B7-H4的异常表达,并参与了结直肠癌的病理进程。第三部分结直肠癌细胞B7-H4异常表达的调控机制探讨【目的】构建并鉴定B7-H4 promoter/PGL3 Basic重组表达载体,筛选与B7-H4启动子特异性结合的转录因子,初步探讨B7-H4在结直肠癌异常表达的调控机制。【方法】正常人全基因组文库克隆得到B7-H4的启动子长片段。构建B7-H4启动子不同片段的PGL3重组载体,分别将其转入结肠癌细胞株或293T细胞,利用荧光素酶分析系统观察其荧光强度的变化。将B7-H4 promoter/PGL3 Basic重组荧光表达载体转入结肠癌细胞株,同时加入TPA处理后,利用荧光素酶报告分析系统观察其荧光强度的变化情况。根据该区域序列结合生物学分析软件(http://genome.ucsc.edu/cgibin/hg Gateway)分析预测与B7-H4启动子区特异性结合的候选转录因子。同时通过染色质免疫共沉淀(Ch IP)验证候选转录因子是否与B7-H4启动子特异区域相结合。【结果】成功构建了B7-H4 promoter/PGL3 Basic重组表达载体及不同截短型PGL3 Basic重组载体,分别将其转入结肠癌细胞株HC T116后,荧光素酶检测结果显示,接近B7-H4开放阅读框上游一段213bp的序列,即A-P1/PGL3 Basic重组表达载体具有较其它片段的PGL3 Basic重组载体更强的荧光表达(P0.05),为B7-H4启动子的核心区域;TPA处理各片段重组载体所转染细胞后,荧光素酶检测发现,转染A-B长片段载体的细胞比转染A-P1段载体的细胞具有更强的荧光表达(P0.05);生物学分析B7-H4启动子区序列后筛选得到两个可能与其结合的转录因子FOXA1和STAG1,经过Ch IP-PCR实验验证,结果表明FOXA1在LS-174T细胞中未与B7-H4启动子序列结合,而STAG1与该序列有一定的结合作用。【结论】本研究首先发现了B7-H4启动子的核心区域,进一步荧光素酶检测发现,TPA作用后转染A-B片段载体的细胞比转染A-P1段载体的细胞具有更高的荧光表达,由此推测TPA可能促使了下游转录因子与B7-H4扩展区启动子的结合,从而导致肿瘤细胞B7-H4上调表达,STAG1可能参与了这一调节。综上所述,本课题通过阐明B7-H4及PKC-δ在结直肠癌中的表达相关性及其临床意义,初步探讨了PKC信号对结直肠癌细胞B7-H4表达的调节作用及其机制,为寻找有效的结直肠癌干预治疗手段提供了新的理论并具有潜在的应用价值。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.34

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本文编号：1625756