完全性葡萄胎遗传易感基因及其对绒癌细胞生物学行为作用的研究

发布时间：2018-03-18 06:00

本文选题：全外显子测序　切入点：散发性完全性葡萄胎　出处：《浙江大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：完全性葡萄胎(Complete hydatidiform mole,CHM)是一种具有恶变倾向的良性滋养细胞疾病。流行病学的数据显示,完全性葡萄胎的种族或地域分布存在明显差异,这提示其发病可能与亲代的遗传有关。现阶段的细胞遗传学和分子生物学的研究结果发现,葡萄胎是雄性基因表达过度导致的,完全性葡萄胎是单独雄性基因表达的结果;双亲来源葡萄胎发病与母系印迹基因突变的关系已有所揭示,但迄今对非家族性复发性完全性葡萄胎(散发性葡萄胎)中母系基因的缺失与母系遗传背景的关系几乎一无所知。近几年,测序技术的高速进展,让在芯片的高通量技术上发展的测序技术,即二代测序技术(next-generation sequencing,NGS)应时出世。芯片技术的形成成功地提升了发现疾病相关的及个体相关的基因突变的水平。全外显子组测序(whole exome sequencing,WES)是凭借人类基因组中外显子区的蛋白质编码序列(coding sequence)为目标的第二代测序技术,存在于外显子组(exome)的序列甚至都没有人类整个基因组序列的1%,但在已有研究发现及文献报道的人类的单基因遗传病中,其中85%的致病突变位点是位于外显子区域的。已有研究显示,WES能发现个体家族性遗传疾病和一些具有复杂性状的遗传病的低频突变,提示利用该技术有助于筛查和发现葡萄胎发病相关的易感基因。绒毛膜癌(简称绒癌,Choriocarcinoma)是一种来源于胚胎滋养细胞的高度恶性肿瘤,继发于葡萄胎、流产或足月分娩。与其它恶性肿瘤相比,不同的是它极易通过血道,在很早期便可转移至全身,而其它肿瘤往往晚期才发生血运转移。查阅文献发现,葡萄胎遗传易感基因MIIP与这种恶性滋养细胞肿瘤的早期转移的行为关系迄今为止未被研究。本研究应用全外显子测序对罹患完全性葡萄胎和已有一次正常妊娠的中国汉族妇女进行可能的易感基因突变筛查。再通过生物学信息分析后,获得候选易感基因,同时进一步通过能精确检测及验证的单碱基延伸和激光解吸离子化-飞行时间质谱进行二次筛查。最后将对候选易感基因,进行金标准Sanger测序的验证。在此基础上,通过查阅文献,了解部分易感基因的功能,选择对调控细胞侵袭、转移等恶性生物学行为MIIP基因,在绒癌细胞中进行体外基因功能实验及机制探究。旨在了解完全性葡萄胎发病易感基因和及其对绒癌恶性生物学行为的作用。第一部分通过全外显子测序技术揭示完全性葡萄胎中ERC1及KCNG4突变的遗传易感性目的:筛查母系遗传背景在母系基因缺失的非家族性复发性完全性葡萄胎中可能遗传易感基因。方法:通过二代测序技术(NGS)方法中的全外显子组测序技术(WES),对51例非家族性复发性完全性葡萄胎患者及47例已分娩一次的正常孕妇的外周血DNA进行遗传易感性的筛查。再通过单碱基延伸[Single base extension,SBE]和激光解吸离子化-飞行时间质谱技术[Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF MS]在 199 例完全性葡萄胎患者和 400 例正常对照中进行二次筛查,最后将对候选易感基因,在247例完全性葡萄胎患者及599例正常对照女性(包含205例新增的对照样本)中进行金标准Sanger测序的验证。通过查阅当前文献,推测易感基因与非家族性复发性完全性葡萄胎的可能形成机理。结果:1、在全外显子筛查时,发现了 398,594单核苷酸突变位点,其中罕见的有害突变位点有5301个,罕见突变中包含了 2,033个单位点突变基因和1,054个多位点突变基因2、在Mass-ARRAY进行二次筛查后,发现有三个基因位点可能与散发性的完全性葡萄胎的发生有关,它们分别是ERC1中的c.G48C(p.Q16H)(p=0.01244),KCNG4 中的 c.Gl 114A(p.G372S)(p=0.01156)和 MMIIP 中的 c.C739T(p.R247W)(p=0.023152)3、进行扩大样本验证后,ERC1 中的 c.G48C(p.Q16H)(p=0.0008361),KCNG4中的c.G1114A(p.G372S)(p=0.017728)统计学意义仍然明显。结论:1、ERC1 的 c.G48C(p.Q16H)位点和 KCNG4 的 c.G1114A(p.G372S)位点,这两个位点可能增加完全性葡萄胎的发生几率(p0.05).2、ERC1和KCNG4可能影响减数分裂时中心体的牵拉作用,进而影响卵细胞的减数分裂过程第二部分MIIP基因对绒癌细胞生物学功能影响及可能的相关机制的研究目的:明确MIIP对绒毛膜癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移及裸鼠荷瘤能力等生物学行为的调控作用及其可能的相关通路机制。方法:采用实时荧光定量 PCR(quantitative real-time RT-PCR,qRT-PCR)法检测MIIP在女性生殖器相关组织中的mRNA水平,及在绒癌细胞系和正常滋养细胞模型的细胞系中的mRNA水平。利用Western-blot技术检测蛋白水平的表达。利用细胞转染技术分别在绒癌细胞株JAR和JEG-3中转染MIIP慢病毒干扰序列或阴性对照下调MIIP的表达,在正常滋养细胞模型的细胞株SWAN中转染MIIP表达质粒上调MIIP的表达,分别通过CCK-8法检测肿瘤细胞的增殖能力、流式细胞技术检测细胞凋亡、伤口愈合实验和Transwell联合或不联合matrigel实验检测细胞的侵袭和迁移能力,通过裸鼠荷瘤实验检测细胞的荷瘤能力。通过Western blot检测MIIP在细胞内可能基因的相关通路。结果:1.干扰MIIP的表达促进绒癌细胞株JAR和JEG-3细胞的增殖能力,促进细胞的迁移和侵袭能力,对细胞凋亡无明显影响。2、正常滋养细胞模型细胞株SWAN中上调MIIP的表达抑制细胞增殖,抑制细胞侵袭和迁移,对细胞凋亡无明显影响。3、低表达MIIP基因,对绒癌细胞株JAR细胞的荷瘤能力有增强作用。4.调控MIIP可改变HDAC6和乙酰化α-tubulin表达。结论:1、改变MIIP表达可影响滋养细胞的部分生物学行为,在绒癌细胞中MIIP发挥抑癌功能。2、HDAC6和乙酰化α-tubulin可能参与MIIP对绒癌细胞生物学行为的调控。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.33

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