LncRNA在甲状腺乳头状癌中的表达及功能分析

发布时间：2018-03-18 08:38

本文选题：LncRNA　切入点：基因芯片　出处：《河北医科大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分LncRNA在甲状腺乳头状癌中的表达谱分析目的:为探讨甲状腺乳头状癌的发病机制,本实验应用微阵列芯片技术观察长链非编码RNA(Long noncoding RNA,LncRNA)在甲状腺乳头状癌组织中的表达谱,并分析长链非编码RNA及mRNA在甲状腺乳头状癌组织与无瘤甲状腺组织中的表达是否存在差异。方法:收集2014年4月~2014年11月在唐山市工人医院手术切除的36例甲状腺乳头状癌组织及癌旁无瘤甲状腺组织标本,所有病例均经病理诊断证实,且均为首次发病初次手术,术前均未进行化疗、放疗和其他针对甲状腺乳头状癌的治疗。所有组织离体后立即置于液氮中,保存于唐山市工人医院中心实验室。选择3例甲状腺乳头状癌组织及对应癌旁无瘤甲状腺组织,应用微阵列芯片技术完成长链非编码RNA表达谱的检测。其余33例应用Real-time PCR方法检测随机选取的8条差异表达的长链非编码RNA,用于表达谱芯片结果的验证。芯片结果扫描图要求信号均匀,清晰,没有边缘化效应、刮伤等影响信号值,阳性定位点和阴性对照区域结果明显。芯片标准化后分析差异表达的长链非编码RNA和差异表达mRNAs,筛选基准为2倍差异,进一步对差异表达mRNAs进行GO分析及KEGG通路分析,还对差异表达的长链非编码RNA进行了亚组分析及与相应mRNAs联合分析。Real-time PCR实验数据采用2-△△Ct法进行分析。组间差异采用t检验,P0.05认为差异有统计学意义。结果:1长链非编码RNA表达谱芯片分析显示,甲状腺乳头状癌组织与癌旁无瘤甲状腺组织相比,长链非编码RNA表达谱存在显著差异。与无瘤甲状腺组织相比,甲状腺乳头状癌中表达差异具有2倍以上的长链非编码RNA有675条,其中上调的有312条,下调的有363条(P0.05);具有2倍以上差异的mRNAs有751条,其中上调的有499条,下调的有252条(P0.05)。2go分析包括分子功能(molecularfunction),生物过程(biologicalprocess)和细胞组分(cellularcomponent)三部分,与癌旁无瘤甲状腺组织比,甲状腺乳头状癌组织中表达下调的基因中,与分子功能相关的基因有170个,与生物过程相关的有159个,与细胞组分相关的有187个。分子功能中占比例最大的为oxygentransporteractivity(氧转运体活性),生物过程中占比例最大的为negativeregulationoftransporteractivity(转运蛋白活性负调控),细胞组分中占比例最大的为myofibril(肌原纤维)。上调的基因中与分子功能相关的基因有359个,与生物过程相关的有362个,与细胞组分相关的有376个。分子功能中占比例最大的为proteinbinding(蛋白结合),生物过程中占比例最大的为responsetostimulus(对刺激反应),细胞组分中占比例最大的为plasmamembranepart(质膜部分)。3kegg通路分析显示下调信号通路有7条,最明显的为“fcepsilonrisignalingpathway-homosapiens(human)”通路,上调信号通路有29条,最明显的为“p53signalingpathway-homosapiens(human)”通路。4对长链非编码rna进行亚组分析及与相应mrnas联合分析,结果显示:与癌旁无瘤甲状腺组织相比,甲状腺乳头状癌组织中有7对enhancer-likelncrna-mrna,9对antisenselncrna-mrna和45对lincrna-mrna表达有明显差异。5real-timepcr检测甲状腺乳头状癌组织及癌旁无瘤甲状腺组织中表达有差异的随机挑选的8条长链非编码rnaenst00000503723、enst00000423539、uc003tab.3、nr_073085、enst00000515275、enst00000570022、uc003qef.1和enst00000427243的表达水平。real-timepcr结果分析与芯片结果相一致。说明基因芯片的结果是可靠的。第二部分lncrnaenst00000423539在甲状腺乳头状癌中的表达分析目的:探讨长链非编码rnaenst00000423539在甲状腺乳头状癌中表达变化,并分析其与临床特征之间的关系。方法:收集2014年4月~2014年11月在唐山市工人医院手术切除的57例甲状腺乳头状癌组织及癌旁无瘤甲状腺组织标本,其中男性患者17名,女性患者40名,年龄在17至68岁之间,所有病例均经病理诊断证实,且均为首次发病初次手术,术前均未进行化疗、放疗和其他针对甲状腺乳头状癌的治疗。所有组织离体后立即置于液氮中,保存于唐山市工人医院中心实验室。采用real-timepcr方法检测甲状腺乳头状癌组织及癌旁无瘤甲状腺组织中长链非编码rnaenst00000423539的表达水平。real-timepcr实验数据采用2-△△ct法进行分析。所有数据统计由spss13.0软件处理,两组间长链非编码rnaenst00000423539的表达水平比较采用配对t检验,长链非编码rnaenst00000423539的表达水平与临床一般指标之间的比较采用卡方检验,临床一般指标包括年龄,性别,肿瘤分期,肿瘤大小,是否有淋巴结转移及是否多发。p0.05认为差异有统计学意义。结果:1与无瘤甲状腺组织相比,甲状腺乳头状癌组织中的长链非编码rnaenst00000423539的表达水平明显升高(p0.05),甲状腺癌组织与无瘤甲状腺组织相比,长链非编码rnaenst00000423539的表达水平比值大于2倍的有36例。2甲状腺乳头状癌组织中长链非编码rnaenst00000423539的表达水平与临床一般指标之间的关系比较发现,甲状腺乳头状癌患者长链非编rnaenst00000423539表达水平与淋巴结转移相关(p0.05)。长链非编码rnaenst00000423539表达水平高低与年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤分期及是否多发无关。第三部分抑制lncrnaenst00000423539表达对人甲状腺乳头状癌k1细胞影响的体外研究目的:应用rna干扰技术,抑制长链非编码rnaenst00000423539在甲状腺乳头状癌k1细胞中的表达,分析长链非编码rnaenst00000423539对甲状腺乳头状癌k1细胞增殖、侵袭能力的影响,为以长链非编码rnaenst00000423539为靶点的甲状腺乳头状癌治疗提供实验依据。方法:设计并合成2对靶向沉默人长链非编码rnaenst00000423539的小干扰rna(sirna-302,sirna-344)和negativecontrol(nc-sirna)转染甲状腺乳头状癌k1细胞,分组如下:control组(未经转染的k1细胞),nc组(转染非特异性sirna的k1细胞),exp1组(转染enst00000423539-sirna-302的k1细胞),exp2组(转染enst00000423539-sirna-344的k1细胞)。采用real-timepcr方法检测长链非编码rnaenst00000423539在各组中的表达水平并筛选出最有效的sirna。应用有效的sirna沉默长链非编码rnaenst00000423539在甲状腺乳头状癌k1细胞中的表达,分组如下:control组(未经转染的k1细胞),nc组(转染非特异性sirna的k1细胞),exp组(转染有效enst00000423539-sirna的k1细胞),对转染完成的甲状腺乳头状癌k1细胞行平板克隆形成实验检测细胞增殖能力的变化,行transwell侵袭实验,观察抑制长链非编码rnaenst00000423539后k1细胞侵袭能力的改变。所有数据统计由spss13.0软件处理,组间比较采用方差分析,p0.05认为差异有统计学意义。结果:12对sirna中,enst00000423539-sirna-344能有效干扰长链非编码rnaenst00000423539在甲状腺乳头状癌k1细胞中的表达,干扰效率超70%(p0.05)。nc组与control组相比差异无统计学意义(p0.05)。2行平板克隆形成实验显示,转染2周后,转染enst00000423539-sirna-344组克隆形成率55±5%,control组与nc组克隆形成率96±4%和95±4%,exp组较control组及nc组克隆形成数明显降低,差异有统计学意义(p0.05),转染enst00000423539-sirna-344后的甲状腺乳头状癌k1细胞增殖明显受限。3在transwell侵袭实验中,control组、nc组、exp组,每个视野甲状腺乳头状癌k1细胞数分别为(57±3.4),(55±4.5),(27±4.3),exp组甲状腺乳头状癌k1细胞穿过ecm胶的数量与对照组比明显降低,转染enst00000423539-sirna-344后的甲状腺乳头状癌k1细胞侵袭能力明显降低(p0.05)。结论:1人类长链非编码rna表达谱芯片结果显示,在甲状腺组织中有大量长链非编码rna转录本产生。进一步分析显示与无瘤甲状腺组织相比,在甲状腺乳头状癌组织中存在675条表达异常的长链非编码rna,其中上调的有312条,下调的有363条。2表达谱芯片结果还显示甲状腺乳头状癌组织与癌旁无瘤甲状腺组织相比mrna的含量也存在显著性差异,长链非编码rna与mrna联合分析,甲状腺乳头状癌组织存在61对表达异常的lncRNA-mRNA。3 Real-time PCR检测甲状腺乳头状癌组织及无瘤组织中长链非编码RNA表达结果与芯片结果相一致,芯片结果是可靠的。4甲状腺乳头状癌组织中长链非编码RNA ENST00000423539的表达水平明显升高,且与淋巴结转移相关,提示长链非编码RNA ENST00000423539参与甲状腺乳头状癌肿瘤的转移。5靶向抑制人甲状腺乳头状癌K1细胞的长链非编码RNA ENST00000423539表达,可以抑制人甲状腺乳头状癌K1细胞的增殖能力及侵袭能力,说明长链非编码RNA ENST00000423539参与了甲状腺乳头状癌的增殖及侵袭过程,沉默长链非编码RNA ENST00000423539基因有望应用于甲状腺乳头状癌的靶向治疗。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R736.1

【参考文献】