基于全外显子组及转录组测序系统研究BMP5参与散发性结直肠癌发生、发展的分子机制

发布时间：2018-03-18 22:28

本文选题：散发性结直肠癌　切入点：全外显子组测序　出处：《西北大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景：散发性结直肠癌(sporadic colorectal cancer, sCRC)是由大肠粘膜上皮起源的恶性肿瘤,其患病比例约占结直肠癌(Colorectal cancer, CRC)的70%,是我国常见的五大恶性肿瘤之一。近年来,CRC的患病率及死亡率上升趋势不减,严重威害大众的健康。从分子水平上看,研究已报道的sCRC标识物主要集中在APC, KRAS及TP53基因等以及围绕这些基因展开的系统功能及分子机制研究。然而这些已报道的基因对sCRC发生的解释度仍有限。随着组学时代的到来,系统地从全基因组范围内筛查并确定sCRC新的候选基因,有助于我们进一步认知其发病的分子发病机制。全外显子组测序技术的出现,以及测序成本的逐渐降低,使我们从海量人类基因组变异数据中筛选与疾病相关变异基因成为可能。相比于测序,更重要的是如何从这些数据中快速准确地挖掘出我们感兴趣的候选基因,而这些基因在研究模型中处于怎样的地位,也是要深入挖掘的。研究方法：1、我们首先从3例中国汉族sCRC癌组织样本入手,通过全外显子组测序技术及数据质控分析,结合基于功能缺失(Loss of Function)突变的筛查策略以及自身组织-血液样本一代重测序验证,确定新的sCRC癌组织特异LoF突变位点。结合相关生物信息分析,确定具有抑癌或错配修复功能的候选基因。2、从DNA突变,RNA及蛋白表达水平深入研究候选基因是否在sCRC临床样本中发生显著性改变。在100-110例独立样本中对候选基因的编码区进行深度测序,统计突变频率；收集获取28例sCRC癌组织及正常组织RNA,利用实时定量荧光PCR验证候选基因在两组间的表达差异；对可能的候选基因利用组织芯片的免疫组化确定其在sCRC癌组织及癌旁正常组织中的蛋白表达差异。系统综合分析这三种不同水平的信息结果,确定可能作为sCRC的新抑癌基因。最终确定骨形态发生蛋白5(BMP5)为sCRC高可信抑癌基因。3、通过体外细胞实验观察BMP5的缺失和获得对CRC细胞生物学性状的影响,体内裸鼠成瘤实验进一步探讨BMP5对肠癌细胞裸鼠成瘤的影响。4、通过转录组测序确定BMP5可能影响的下游差异表达基因,深度分析BMP5在肠癌模型中的功能表型。确定BMP5是通过何种信号途径影响重要的下游基因进而参与CRC的发生、发展。结果：1、利用全外显子组测序技术,经数据质控筛查分析确定3例sCRC癌组织特异的LoF突变基因共72个。通过生物信息数据库查询、基因功能分析确定可能具有抑癌或错配修复作用的重要基因5个：BMP5、DDI2、RASSF6、SARDH, C9orf9。2、临床样本编码区深度测序发现BMP5的突变频率最高,为7.7%(8/104),其中7例为致病性突变；28例成对样本的RNA水平表达显示,BMP5在sCRC癌组织中的表达显著低于癌旁正常组织(P0.0001),其中下调差异倍数在1.5倍以上的23例(82.1%,23/28),平均下调差异倍数5.72倍。129例成对样本的免疫组化研究确定BMP5在正常肠组织中的阳性表达显著高于癌组织(89.1% vs 75.2%,P=0.0053)。BMP5的表达与患者的性别、年龄以及病理分期均无相关性。综合以上几个方面的分析,我们认为BMP5的高突变率及低表达率,是其作为sCRC新候选抑癌基因的可靠依据。3、体外细胞水平实验显示,BMP5的获得及缺失能够影响CRC细胞系HT-29及SW480的增殖能力,但这种增殖能力的影响可能不是因细胞凋亡所引起。SW480细胞系中BMP5的缺失能够促进癌细胞的迁移及侵袭能力,但BMP5的获得对其影响不显著,尤其是细胞侵袭实验。体内裸鼠成瘤实验显示,过表达BMP5的HT-29在裸鼠体内的成瘤速度要显著低于对照组(P=0.033)。4、转录组测序的结果显示,在HT-29细胞系中BMP5的表达上调可引起基因组内366个基因的差异表达,其中主要表现为下游基因的表达抑制。信号通路及共表达分析的结果显示BMP5可能通过Jak-STAT信号通路抑制EPSTI1(epithelial stromal interaction 1)的表达。结论：基于LoF突变的筛查策略可以快速的寻找与肿瘤发生相关的重要突变基因。临床样本中BMP5的突变及其低表达可能作为sCRC组织特异的标识物。BMP5在CRC模型中能够抑制细胞的增殖及迁移、侵袭行为,具有抑癌作用。BMP5可能存在非Smad依赖的信号通路,即通过Jak-STAT通路影响EPSTI1的表达改变,暗示BMP5的表达异常可能是sCRC发生的早期事件,这一结果在先前并未见报道。本课题运用组学的角度系统挖掘sCRC潜在的分子标识,为sCRC发病的分子机理提供新的证据及理论基础。
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【学位授予单位】：西北大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.34

【参考文献】