云南地区结直肠癌遗传异质性的研究

发布时间：2018-03-21 07:27

本文选题：结直肠癌　切入点：基因突变　出处：《昆明理工大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是人类最为常见的恶性肿瘤之一,随着我国经济发展和人民生活水平的提高,生活方式及饮食结构的改变,CRC发病人群呈年轻化、发病率呈逐年上升趋势,严重威胁着我国人民的身心健康。云南高原地区具有特殊的地理环境和多变的气候环境,聚集多个少数民族,多元化的地方风俗,多元化的饮食习惯等特点,导致云南地区人群肠道微环境的独特性,可能影响CRC的发病、瘤内异质性和基因突变谱。随着靶向药物逐渐应用于肿瘤的临床治疗,CRC的靶向治疗也向前迈出了重要的一步,靶向治疗能明显延长转移性CRC患者的生存时间,是目前治疗转移性CRC最理想的方案。但是,由于肿瘤异质性导致靶向基因检测的困难,从而影响了疗效。肿瘤异质性是人类恶性肿瘤的重要特征之一,CRC的异质性主要是指肿瘤在生长过程中,经过多次分裂增殖,其子细胞呈现出分子生物学或基因方面的改变,从而使CRC的生长速度、侵袭能力、乃至药物的敏感性、预后等各方面产生异质性。CRC瘤内异质性往往会给其治疗带来极大的困难,它与肿瘤微环境中的酸碱度、氧含量以及葡萄糖含量等有着密切关系。由于瘤内异质性的存在,可能导致检测结果为假阴性,从而影响临床医生对CRC患者病情的评估。因此,正确认识云南地区环境因素导致的CRC异质性,有助于CRC的诊断及治疗方案的选择。基因测序是检测基因突变的重要方法,而传统的毛细管电泳技术在多个基因进行测序时,不仅费时、费力,而且价格较贵。二代测序技术(Next-generation sequencing,NGS)能同时对肿瘤的多个靶基因进行平行测序,具有通量高、速度快和价格便宜等优点,是多基因测序的最佳选择。本研究基于IlluminaNGS测序平台,首先对来自3例CRC患者不同空间位置的10个肿瘤样本及其癌旁正常组织,分析了 329个肿瘤相关基因的突变情况。结果发现CRC患者在原发灶和肝转移灶的瘤内均存在组织分化程度上的异质性。2例CRC患者瘤内基因突变一致率分别为75%、70.4%。1例CRC伴肝转移患者中,原发灶、肝转移灶瘤内分别有82.8%、90.3%的基因突变相同,原发灶和肝转移灶之间87.9%的基因突变相同。这些结果表明基因突变在肿瘤不同空间位置上存在一定的异质性,可能与CRC原发灶在发展过程中,不同空间位置的微环境有关,也可能与肝转移灶到了另一个新的微环境后,发生了新的基因突变有关。3例CRC患者共检测到了 59个基因突变,其中有50个基因突变完全不一致,而9个相同的基因突变当中,又有4个基因的突变位点不一致。这一结果提示CRC患者个体间基因突变的差异较大,可为临床个体化治疗提供了理论依据。为了进一步了解KRAS基因在云南地区CRC中的突变率,我们分析了 247例CRC患者KRAS基因第12、13密码子突变情况,共有59例发生了突变,突变率为 23.9%,突变类型有 G12D、G12V、G12A、G12C、G12R、G13D,与以前报道过的类型一致,提示KRAS基因在CRC发病进程中起到了关健作用。KRAS基因的第12、13密码子突变与性别、年龄、肿瘤原发部位、分化程度、临床分期以及TNM分期多项临床特征之间均没有显著性差异,表明KRAS基因突变可能是CRC发病进程的极早期事件。接着我们分析了 26例CRC患者不同空间位置的144个样本(包括2例伴有肝转移)的KR4S、BRAF、PIK3C4基因突变和异质性情况。发现7例CRC患者发生了KRAS基因突变,突变率为26.9%。2例发生了PIK3CA基因突变,突变率为7.7%。1例患者同时发生了KRAS、PIK3C4基因突变。所有样本中没有发现BRAF基因突变。2例肝转移灶瘤内没有发现这三个基因的突变。7例发生了KRAS基因突变的CRC患者中,4例患者的5个不同空间位置没有发现该基因突变的异质性,3例患者存在不同空间位置的异质性。2例存在PIK3CA基因突变的患者中,有1例存在该基因突变的异质性。这些发现为临床精准诊疗提供了参考依据。已有研究表明,线粒体作为能量工厂,可能更容易受到肿瘤微环境的影响,使得肿瘤细胞线粒体DNA(mitochondria DNA,mtDNA)呈现更多异质性,可能对CRC的进程和疗效产生影响。为进一步认识CRC患者瘤内异质性,我们对mtDNA D-loop区的突变和瘤内异质性进行了研究。我们分析了 22例云南地区CRC患者不同空间位置的88个样本,发现有10例CRC患者mtDNA D-loop区发生了突变,突变率为45.5%。突变位点分别为HVSI的16114、16166、16248、16278、16304、16362 及 16390 位点,HVSⅡ 和 Ⅲ 的 71、309 及 573 位点,其中309点位点突变最多,有2例同时在HVSⅠ、HVSⅡ和Ⅲ有突变,其余患者均只发生了一个位点突变。10例发生了 mtDNAD-loop区突变的样本中,6例突变位于HVSⅠ,6例突变位于HVSⅡ和Ⅲ(2例同时发生了 HVSⅠ突变),其中有9例存在瘤内mtDNAD-loop区突变的异质性,与前面所述的核基因突变相比,肿瘤细胞mtDNA的异质性程度明显偏高。然而,鉴于上述异质性位点发生的复杂性,有关上述异质性突变产生的方式,及其是否有功能性改变等均需有待深入研究。综上所述,云南地区CRC患者不仅存在个体间基因突变的异质性,而且还存瘤内异质性。CRC患者个体间大部分基因的突变不一致,甚至相同的基因突变还存在突变位点不一致的情况,这一发现与已有的报道一致。同时,瘤内不同空间位置基因突变异质性为9.7%-25%,这些数据为在云南地区实施个体化治疗提供了理论支持。另外,对KR4S基因的分析表明,云南地区CRC患者KRAS基因突变率为26.9%,与已有报道的亚洲人突变率一致。11.5%的CRC患者存在瘤内KRAS基因突变异质性,有研究报道8%的CRC患者存在瘤内KRAS基因突变异质性,也有研究报道36%的CRC患者存在瘤内KRAS基因突变异质性。临床CRC患者KRAS、PIK3C4基因检测为野生型时,使用抗EGFR靶向药物疗效仍然较差,可能是由于KRAS、PIK3C4基因的瘤内异质性,导致了单一位点的取样检测结果偏差。我们对肿瘤细胞mtDNA的分析结果表明,mtDNA突变的瘤内异质性程度明显高于核基因突变的异质性,可能是由于mtDNA对肿瘤微环境因素的变化更为敏感,进一步体现了基因与环境的互作关系。云南地区CRC肿瘤内部基因突变的异质性,要求我们在临床检测评估CRC患者的基因突变状态时,应尽量多的在肿瘤组织的不同空间位置取样,避免用单一位点的状态来解释整个肿瘤组织的情况,以期为云南地区CRC患者提供更为精准的诊断、预后和治疗策略。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.34

【相似文献】