结直肠癌标志性microRNA分子的筛选及其功能研究

发布时间：2018-03-22 00:27

本文选题：结直肠癌　切入点：分子标志物　出处：《吉林大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景：结直肠癌是常见的消化道肿瘤之一，每年全世界范围内的新增病例超过100万例，位于肠壁内的原发性结直肠癌采用手术和化疗往往能够收到比较好的治疗效果，5年生存率约为90%，即使在发达国家，结直肠癌的总体致死率仍有33%之多。尽管癌组织周边淋巴结未检测到明显转移灶，其复发率也可达25%，绝大多数死亡的结直肠癌病例均是由于出现远端转移，因此，早期检查和治疗是有效降低结直肠癌致死率的关键。目前的临床检测方法主要是病理组织染色，为提高诊断准确性，尤其是预测患者对常规疗法的应答水平，更好地指导诊断和用药，往往辅以分子标志物的检测。采用分子标志物作为结直肠癌诊断和预后指标具有很多优越性，但潜在的标志蛋白质分子多涉及癌症的各种增殖或凋亡信号通路，通常存在诸多突变型，增加了检测的困难程度和结果的不确定性。另外，较大的个体差异也是其推广应用的一大阻碍。核型分析也存在类似的问题，检测手段繁琐，个体重复性差，使得这些检测方法只能作为常规病理检测手段的辅助选项，对于临床诊断和疗效预测贡献极小。miRNA直到近些年才被纳入分子标志物的选择范畴，它具有检测方便、成本低廉、灵敏度高等优点。本课题的目的就是在于筛选并获得结直肠癌特异性miRNA分子，并详细阐述其生物学功能与临床意义。方法：首先采用miRNA检测芯片分析5例结直肠癌组织和癌旁正常组织的miRNA表达谱，对比筛选差异基因。再扩大样本量至30例，用Realtime-PCR验证筛选结果，分析其表达水平与结直肠癌分级分期的相关性，同时检测结直肠癌细胞系和正常结肠细胞该miRNA的表达差异。确定差异显著的miRNA后，在结直肠癌细胞系中通过质粒过表达和消减表达的实验，，研究该miRNA的生物学功能。随后采用软件分析其序列并预测目的基因，以荧光素酶报告基因系统和定量PCR、免疫印迹等方法进行验证，并在结直肠癌细胞系中研究miRNA及其调控靶基因对细胞增殖、周期和侵袭能力的调控作用。最后，在小鼠移植瘤模型中验证体外实验结果，通过对比瘤重、肿瘤体积等数据，确定该miRNA对在体肿瘤组织生长的影响。结果：芯片检测结果发现，与相应的癌旁对照组织相比较，miR-103在结直肠癌组织中高表达，并且与另外30例组织标本检测结果一致，同时miR-103的表达水平与结直肠癌患者肿瘤组织的转移性和TNM分期相关。进一步验证miR-103在结直肠癌细胞系中表达水平也显著高于正常结直肠细胞。在结直肠癌细胞系HCT-116中验证，miR-103可促进细胞增殖和侵袭。通过软件预测和荧光素酶报告基因系统以及定量PCR、免疫印迹等方法，我们发现miR-103可直接调控DICER和PTEN的表达水平。在HCT-116细胞中，miR-103可明显逆转DICER和PTEN的表达，进而抑制细胞的增殖和侵袭。构建荷瘤裸鼠模型，通过体内实验证实上述结果，消减表达miR-103后，肿瘤组织PTEN表达量显著上调，而对肿瘤生长具有显著的抑制作用。结论：通过本课题的研究，我们利用基因芯片技术筛选到了在结直肠癌中高表达的微小RNA miR-103，并初步证实其表达水平与结直肠癌的肿瘤转移和TNM分期呈正相关。同时，通过细胞实验，我们进一步证实miR-103参与调控结直肠癌细胞的增殖和侵袭。随后，发现并证实在结直肠癌细胞中，DICER和PTEN可做为miR-103的靶基因，miR-103可通过调控DICER和PTEN的表达，进而调控细胞的增殖、周期和侵袭能力。最后，通过体内抑瘤实验，证实miR-103可通过其靶基因DICER和PTEN参与调控肿瘤的生长，而消减miR-103的表达，可以显著逆转DICER和PTEN的表达，并有效抑制肿瘤生长。我们的研究证实在结直肠癌中，miR-103表达上调且与肿瘤的侵袭性和TNM分期密切相关，并初步阐明其介导肿瘤发生发展的分子机制，提示miR-103可做为结直肠癌发生发展的潜在分子标志物，为结直肠癌的临床检测提供新的检测靶点和理论依据。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.34

【共引文献】