HMGB1调控的自噬致非小细胞肺癌吉非替尼获得性耐药机制和后续治疗策略研究

发布时间：2018-03-23 05:08

  本文选题：非小细胞肺癌　切入点：吉非替尼　出处：《浙江大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的明确自噬与非小细胞肺癌吉非替尼获得性耐药的相关性,同时阐明调控靶点HMGB1在自噬介导的吉非替尼NSCLC获得性耐药中的关键作用,以及Bcl-2和Beclin-1信号通路与HMGB1及吉非替尼NSCLC获得性耐药的关系。研究方法1.在吉非替尼敏感NSCLC细胞系PC9 (EGFR 19外显子缺失)上,经吉非替尼处理不同时间,构建吉非替尼获得性耐药细胞株PC9-R(EGFR T790M、Met扩增均为阴性)。通过AO染色检测酸性囊泡、Western blot检测耐药过程不同阶段自噬标志蛋白LC3 Ⅰ、Ⅱ、p62 (SQSTM)表达,明确在吉非替尼获得性耐药与自噬的相关性。2.采用小分子RNA干扰技术/脂质体转染技术,构建沉默/过表达HMGB1的PC9细胞,以不同浓度吉非替尼处理后,MTT法检测考察抗肿瘤活性,Western blot检测自噬标志蛋白LC3 Ⅰ/Ⅱ、p62表达,免疫组化法检测LC3 Ⅰ/Ⅱ的分布,明确HMGB1对自噬调控及吉非替尼获得性耐药的影响。3.针对信号转导通路HMGB1/Beclin和MAPK/Bcl2/HMGB1,以Western blot为检测吉非替尼获得性耐药中Beclin-1、Bcl2、pJNK、pERK和p38表达的变化,考察自噬诱导的吉非替尼获得性耐药中]HMGB1与Beclin-1和Bcl2的相互作用和结合情况。结果1.吉非替尼耐药过程中,自噬标志蛋白LC3发生Ⅰ型向Ⅱ型的转化、p62表达下降,表明吉非替尼获得性耐药过程中出现自噬。采用自噬抑制剂氯喹以及RNA干扰阻断技术调控自噬水平,通过MTT法检测发现抑制自噬的发生可以明显增加吉非替尼的抗肿瘤活性,证明自噬介导吉非替尼获得性耐药的发生。2.在构建的吉非替尼获得性耐药细胞株PC9/R中,耐药过程中HMGB1的表达明显上调；沉默HMGB1的表达,吉非替尼的抗肿瘤活性明显增强,表明HMGB1参与吉非替尼获得性耐药的发生。另外,在沉默HMGB1表达后自噬标志蛋白LC3 Ⅰ型向Ⅱ型转变减少、p62的下调被逆转,证明HMGB1通过介导自噬过程发挥调控吉非替尼获得性耐药。3.吉非替尼获得性耐药中Beclin-1以及pBcl2表达上调,Bcl2表达减少；抑制Beclin-1能明显增强吉非替尼的抗肿瘤效果,说明Beclin-1参与吉非替尼获得性耐药的发生。在自噬诱导的吉非替尼获得性耐药中HMGB1与Beclin-1的结合明显增多,促进自噬介导的吉非替尼获得性耐药的发生。结论自噬是吉非替尼NSCLC获得性耐药的重要原因,]HMGB1作为关键靶点介导自噬调控的吉非替尼获得性耐药。而Bcl2/Beclin-1作为重要角色参与了HMGB1介导的吉非替尼获得性耐药。
[Abstract]:Objective to investigate the correlation between autophagy and gifitinib acquired drug resistance in non-small cell lung cancer, and to elucidate the key role of target HMGB1 in autophagy mediated gifitinib NSCLC acquired resistance. The relationship between Bcl-2 and Beclin-1 signaling pathway and acquired drug resistance of HMGB1 and gefitinib NSCLC. Methods 1. In Gifitini-sensitive NSCLC cell line PC9, the exon deletion of EGFR19 was treated at different times by gefitinib. The amplification of PC9-R(EGFR T790Met was negative. The expression of autophagy marker protein (LC3 鈪，

本文编号：1652010