宫颈癌中EMC6的自噬作用及相关Rab5a、Beclin1实验研究

发布时间：2018-03-23 16:06

本文选题：EMC6　切入点：自噬　出处：《新疆医科大学》2015年博士论文

【摘要】：研究背景和目的:宫颈癌是威胁全球女性健康的恶性肿瘤。人乳头状瘤病毒的持续感染被认为是导致宫颈癌的必要因素,自噬缺陷可能导致病毒持续感染,从而参与宫颈癌的形成和发展。另一方面,当自噬能力下降时,自噬清除衰老受损的细胞器的能力也下降,从而造成基因毒性成分积累和受损细胞器的堆积,诱发肿瘤的发生。新发现的重要基因EMC6(ER membrane protein complex subunit 6)对自噬具有调控作用,但其在恶性肿瘤组织中的表达及功能尚无报道。EMC6可与已发现的抑癌基因Beclin1及肿瘤转移相关基因Rab5a相互作用,共同参与自噬过程。因此,本实验研究自噬基因EMC6、Rab5a与Beclin1在宫颈癌组织中的表达及相互关系。EMC6基因表达质粒及特异性RNA干扰质粒在体内、体外对宫颈癌细胞生长,自噬影响的差异及相互作用,了解在恶性肿瘤中上述基因在宫颈癌发生发展中的作用,探索自噬诱导在宫颈癌治疗中的可行性,为将来进行基因治疗提供新靶点方面的线索,为其成为潜在宫颈癌治疗策略提供实验基础。方法:1)采用SP法分别检测EMC6、Beclin1、Rab5a在宫颈癌组织、宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)、正常宫颈组织中的表达状况,并分析EMC6表达与宫颈癌患者年龄、临床分期、病理类型、细胞分化程度、是否伴有淋巴结转移等临床病理因素的相关性.2)分析比较在宫颈癌组织、CIN组织、正常宫颈组织中EMC6、Beclin1及Rab5a表达之间的关系。3)构建EMC6基因的真核表达质粒pLenti-CMV-EMC6-PGK-T2A-Puro、特异性干扰EMC6质粒p Lenti-u6-shrna-CMV-2A-Puro、空质粒pLenti-u6-ccdb-CMV-T2A-Puro。分别将这三种质粒转染HeLa细胞,筛选稳定表达株。用Real time-PCR检测三组质粒转染后Hela细胞中EMC6mRNA表达结果。4)用透射电镜观察细胞株内是否有自噬体形成。用激光共聚焦显微镜观察处理组、空白质粒组及HeLa细胞株中GFP-LC3。其后用bafilomycin A及3MA分别作用于三组HeLa细胞株,再用共焦显微镜观察细胞株中GFP-LC3的变化。5)使用Real time-PCR、Western blot分别检测EMC6基因稳定过表达的HeLa细胞和EMC6基因稳定不表达的HeLa细胞中Rab5a和Beclin1表达情况。6)将HeLa、HeLa-EMC6及HeLa-shRNA表达株分别接种到裸鼠皮下成瘤,建立雌性裸鼠异体移植宫颈癌模型,观察比较三组瘤体生长速度及瘤体大小及肿瘤,剥下瘤体免疫组化检测比较三组瘤体组织中emc6蛋白、rab5a蛋白及beclin1蛋白的表达水平。7)统计方法:等级资料采用秩和检验,计量资料采用方差检验,计数资料采用卡方检验,多组间两两比较等级资料的统计均采用秩和检验,多组数据组间两两比较采用非参数检验中的kruskal-wallis检验法。相关性分析采用非参数spearman法等级相关法检验。使用spss22.0统计软件进行运算,以α=0.05为检验水准(双侧)。结果:1)在100例宫颈癌组织中emc6蛋白表达阴性占36.0%(36/100),弱阳性占18.0%(18/100),强阳性占46.0%(46/100).在80例cin组织中emc6蛋白表达阴性占6.3%(5/80),弱阳性占6.3%(5/80),强阳性占87.5%(70/80),80例正常宫颈上皮组织emc6蛋白表达阴性为18.8%(15/80),弱阳性占25.0%(20/80),强阳性占56.2%(45/80)。emc6蛋白在宫颈癌组织中阳性表达最低,在cin组织中阳性表达最高,差异有显著性(p0.05)。2)beclin1在宫颈癌组织中表达阴性占38.0%(38/100),弱阳性占50.0%(50/100),强阳性占12.0%(12/100);cin组织中表达阴性占6.25(5/80),弱阳性占62.50%(50/80),强阳性占31.25%(25/80);正常宫颈组织中表达阴性占18.75%(15/80),弱阳性占31.25%(25/80),强阳性占50.0%(40/80)。beclin1蛋白在宫颈癌组表达比例低于cin组、正常宫颈组(p0.05),cin组织中beclin1蛋白表达高于正常宫颈组织,差异有显著性(p0.05)。3)rab5a蛋白在宫颈癌组织中表达阴性占25.0%(25/100),弱阳性占37.0%(37/100),强阳性占38.0%(38/100);cin组织中表达阴性占31.25%(25/80),弱阳性表达占25.00%(20/80),强阳性表达占43.75%(35/80);在正常宫颈组织阴性表达占75.00%(60/80),弱阳性表达占17.50%(14/80),强阳性的表达为7.5%(6/80)。宫颈癌组织和cin组织中rab5a蛋白表达水平高于正常宫颈组织(p0.05);而cin组织与宫颈癌组织之间无差异(p0.05)4)宫颈癌中emc6蛋白表达和beclin1表达与患者年龄、临床分期、肿瘤大小、大体类型、肿瘤病理类型、细胞分化程度、淋巴结转移等均无相关性(p0.05)。宫颈癌中rab5a蛋白表达与临床分期、肿瘤大小无关(p0.05),低分化组表达高于中高分化组(p0.05),伴有淋巴结转移组表达高于无淋巴结组(p0.05)。5)用免疫组化方法检测emc6蛋白在宫颈癌组织、cin组织、正常宫颈组织中表达水平与beclin1蛋白、rab5a蛋白表达水平无关(p0.05)。6)rt-pcr法检测转染plenti-cmv-emc6-pgk-t2a-puro质粒后,hela细胞中emc6mrna明显增高(p0.05),转染plenti-u6-shrna-cmv-t2a-puro质粒后,hela细胞中emc6mrna明显减低(p0.05),转染plenti-u6-ccdb-cmv-t2a-puro(空质粒)后,细胞中emc6mrna无明显变化(p0.05)。7)激光共聚焦显微镜观察,处理组较空质粒组、hela细胞内gdp-lc3明显增多,bafilomycina1可使三组细胞内出现gfp-lc3的聚集,以处理组内lc3斑点最丰富。3-ma可使转染处理组、空质粒组及hela中的lc3斑点均出现降低。8)通过pcr和westernbolt方法,检测了emc6过表达hela细胞株中rab5amrna、rab5a蛋白和beclin1mrna、beclin1蛋白表达水平增加,EMC6特异性被干扰或抑制HeLa细胞株中,Rab5amRNA、Rab5a蛋白和Beclin1mRNA、Beclin1蛋白表达下降。9)与HeLa组(未转染质粒)裸小鼠相比,Hela-shRNA组(EMC6被干扰)裸小鼠致瘤活性明显增强,生长加快,瘤体体积明显变大(P0.05)。HeLa-EMC6(EMC6过表达)细胞裸小鼠致瘤活性明显降低,生长减慢,瘤体体积明显缩小(P0.05)。Hela-shRNA组裸小鼠瘤体平均重量1.03±0.12g,较He La组肿瘤增重28.75%(P0.05);HeLa-EMC6组瘤体平均重量0.39±0.14g,较HeLa组明显减轻51.25%(P0.05)。10)免疫组化检测显示HeLa-EMC6组瘤体中,Rab5a蛋白、Beclin1蛋白表达高于Hela-shRNA组及He La组,Hela-shRNA组瘤体中,Rab5a蛋白、Beclin1蛋白表达低于HeLa组。结论:1)新发现的EMC6基因在正常宫颈组织、CIN、宫颈癌组织内均有表达。在“正常宫颈-宫颈上皮内瘤样病变-宫颈癌”这一连续病理过程中,CIN组织中EMC6表达升高,而在宫颈癌组织中表达下降。推测EMC6缺失可能参与了宫颈癌的发生发展过程,其具体机制不明。EMC6的表达与宫颈癌患者年龄、FIGO分期、肿瘤大小、肿瘤大体类型、肿瘤病理类型、细胞分化程度、有无淋巴结转移等均无相关性,表明EMC6的降低在宫颈癌早期既已发生。2)在宫颈癌组织、CIN组织、正常宫颈组织中,EMC6蛋白表达水平与Beclin1、Rab5a蛋白表达水平无直接相关性。3)上调或下调宫颈癌细胞内EMC6,可同时引起细胞内Rab5a、Beclin1出现相应上调或下降,推测EMC6可能位于Rab5a蛋白作用的上游,具有抑瘤作用。4)本研究通过雌性裸鼠移植瘤模型探讨EMC6对宫颈癌HeLa细胞体内致瘤活性和生长的影响。通过结果分析,EMC6蛋白在裸鼠体内能明显抑制He La细胞生长,致瘤性降低。对裸鼠瘤体进行免疫组化检测,在过表达EMC6的较小瘤体组织中Rab5a、Beclin1表达增高,在EMC6表达下调的较大瘤体组织中Rab5a、Beclin1蛋白表达也下调。5)基于以上实验结果,推测若选择先新发现EMC6作为基因治疗的靶点,既可以抑制Rab5a蛋白在癌转移侵蚀方面的作用,同时又促进了Beclin1自噬抑瘤作用。为宫颈癌乃至肿瘤的靶向治疗提供了新的研究方向。
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【学位授予单位】：新疆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.33

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