Notch-1与NF-κB协同调控肿瘤细胞迁移的交互作用机制研究

发布时间：2018-03-23 16:21

  本文选题：Notch-1　切入点：NF-κB　出处：《电子科技大学》2016年博士论文

【摘要】：癌症是威胁人类生命最严重的疾病之一,据美国癌症协会2015年最新的年度统计数据报告显示肺癌、结肠癌、前列腺癌和乳腺癌仍然是癌症死亡的最常见原因。世界癌症报告估计2012年我国癌症发病人数约360万,癌症死亡人数约为220万,约占全球癌症死亡人数的四分之一,而90%的肿瘤病人死于癌症的转移。转移是肿瘤恶性行为的特征性表现,也是临床治疗失败的主要原因,控制转移成功与否是决定癌症患者生存与否的关键。但肿瘤是多基因控制的复杂疾病,深入研究癌症发生与转移的分子机制,对未来的靶向治疗癌症具有非常重要的作用。Notch信号通路高度保守,最先发现是在胚胎发育和细胞分化方面起作用,随后的大量研究发现异常活化的Notch信号通路与肿瘤的发生和发展有关。Notch-1及其配体的过表达与乳腺癌的预后率密切相关。然而,Notch-1信号通路在乳腺癌中的作用机制并不清楚。本研究以高转移性乳腺癌细胞系MDA-MB-231为研究对象,首先分析Notch家族受体Notch-1对乳腺癌细胞恶性行为的作用,证实了Notch-1活化促进乳腺癌细胞的生长、黏附、迁移和侵袭等恶性行为。然后阐明了Notch-1促进细胞迁移的机制。研究内容如下:1.细胞模型的构建:通过反转录PCR从人脑胶质瘤细胞系U251细胞中获取人Notch-1胞内段(NICD)的序列全长cDNA,并克隆到载体pcDNA3.1(+)中。通过瞬时转染进MDA-MB-231细胞中,经Real-time PCR和Western blot鉴定转染后细胞中NICD成功过表达。Notch-1 shRNA经瞬时转染后也有效降低Notch-1的表达。2.Notch-1对乳腺癌细胞恶性行为的作用:(1)通过CCK-8、平板克隆以及软琼脂糖克隆形成实验分析细胞增殖能力证明过表达NICD能够促进细胞增殖,而沉默Notch-1则会抑制细胞增殖。(2)通过流式细胞术和Calcein AM/PI双染发现NICD过表达促进细胞周期大量进入S期并抑制细胞凋亡,沉默Notch-1则将细胞周期阻滞才G0/G1期且促进细胞凋亡。(3)通过细胞黏附分析实验、划痕实验以及Transwell小室实验证实NICD过表达促进细胞的黏附、迁移和侵袭。相反,沉默Notch-1则抑制细胞的黏附、迁移和侵袭能力。以上实验表明Notch-1活化对细胞的恶性行为有促进作用。3.Notch-1促进MMP-2、MMP-9、VEGF的表达:Real-time PCR和明胶酶谱实验证实Notch-1活化促进MMP-2、MMP-9和VEGF的表达,并增强MMP-9的活性。沉默Notch-1则抑制MMP-2、MMP-9和VEGF的表达,且MMP-9的活性也随之降低。4.Notch-1活化NF-κB信号通路:(1)通过免疫荧光、western blot、EMSA、双荧光素酶报告基因检测证明Notch-1活化导致IκBα降解,促进NF-κB的p65亚基入核转移,并增强NF-κB与DNA的结合活性和转录活性。沉默Notch-1抑制IκBα降解,导致p65入核转移减少,NF-κB的DNA结合活性和转录活性都降低。(2)Western blot分析证明Notch-1活化促进NF-κB下游靶基因Cyclin D1、Bcl-xL、Survivin的表达。说明Notch-1活化能够激活NF-κB信号通路。5.Notch-1促进细胞侵袭依赖于NF-κB的活性:(1)LPS刺激促进细胞侵袭,并拮抗Notch-1沉默导致的细胞侵袭能力降低。NF-κB抑制剂处理抑制细胞的侵袭能力,并阻断NICD过表达引起的细胞侵袭能力增强。(2)抑制Notch-1活性,LPS处理仍能够增加MMP-2、MMP-9和VEGF的表达。而抑制NF-κB,活化的Notch-1不能促进MMP-2、MMP-9和VEGF的表达。以上结果说明Notch-1促进细胞侵袭必须依赖于NF-κB活性。6.Notch-1活化NF-κB的机制:(1)Western blot分析证明Notch-1活化激活PI3K/AKT信号通路,而抑制PI3K磷酸化则Notch-1活化不能增强AKT的磷酸化水平。(2)Western blot和免疫荧光技术证明抑制AKT磷酸化,Notch-1活化不能诱导p65入核转移。说明Notch-1通过PI3K/AKT途径活化NF-κB。(3)活化Notch-1增强PP2A的磷酸化水平,抑制其活性。PP2A抑制剂OA(冈田酸)抑制PP2A活性后Notch-1沉默不能降低PI3K、AKT的磷酸化水平。免疫荧光染色和western blot分析证实OA抑制PP2A活性后沉默Notch-1不能减少p65入核转移。双荧光素酶报告基因检测也证实了OA抑制PP2A活性增强NF-κB的转录活性,且逆转Notch-1沉默引起的NF-κB转录活性降低。说明Notch-1通过PP2A调控了NF-κB的活性。综上所述,本论文通过分析Notch-1在乳腺癌生长和转移方面的作用,明确了Notch-1活化会促进细胞的生长、黏附、迁移和侵袭。阐明了Notch-1促进细胞恶性行为的机制是调控PP2A活性而调节PI3K/AKT/NF-κB信号通路的活性,进而调节下游与细胞周期、细胞凋亡和运动相关靶基因的表达。该研究阐明了Notch-1调控乳腺癌细胞迁移的机制,并为相关临床研究提供了相应和理论依据和实验基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：电子科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R73-37

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 张丽;夏德雨;李国辉;蒋姗姗;谷芳娜;梁英民;;Notch信号在急性早幼粒细胞白血病患者骨髓中的表达[J];第四军医大学学报;2009年24期

2 姜萌;何奔;;Notch信号对血管新生调控作用的研究进展[J];上海交通大学学报(医学版);2010年05期

3 ;Effect of Trastuzumab on Notch-1 Signaling Pathway in Breast Cancer SK-BR3 Cells[J];Chinese Journal of Cancer Research;2012年03期

4 鲁茁壮,王立生,吴祖泽;Notch信号通路研究进展[J];生理科学进展;2004年02期

5 张谦慎;Notch信号与肺发育[J];中国当代儿科杂志;2004年02期

6 孙力,詹启敏,章文华;Notch信号通路与肿瘤[J];国外医学(肿瘤学分册);2004年09期

7 张谦慎,常立文,刘汉楚,容志惠,祝华平,陈红兵,李文斌;Notch信号与大鼠肺发育的关系研究[J];华中科技大学学报(医学版);2004年03期

8 张谦慎,常立文,刘汉楚,容志惠,陈红兵;TEMPORAL EXPRESSION OF NOTCH RECEPTORS DURING LUNG DEVELOPMENT IN RAT[J];Journal of Shanghai Second Medical University;2005年02期

9 吴颖亚;王季石;;Notch及其配体在血液系统中的作用[J];国外医学.输血及血液学分册;2005年05期

10 张谦慎,常立文,刘汉楚,容志惠,陈红兵;Relationship between Notch Receptors and Hyperoxia-induced Lung Injury in Newborn Rats[J];华中科技大学学报(医学英德文版);2005年02期

相关会议论文 前10条

1 张丽;梁英民;夏德雨;李国辉;蒋姗姗;谷芳娜;;Notch信号在急性早幼粒细胞白血病患者骨髓中的表达研究[A];第12届全国实验血液学会议论文摘要[C];2009年

2 ;Expression profile of Notch-related genes in multi-drug resistant K562/A02 cells compared with parental K562 cells[A];第12届全国实验血液学会议论文摘要[C];2009年

3 ;Notch signaling in lymphopoiesis[A];第10届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2005年

4 韩骅;;Notch信号途径的功能和作用机理的研究[A];全面建设小康社会：中国科技工作者的历史责任——中国科协2003年学术年会论文集（下）[C];2003年

5 赵昱;侯丽宏;马磊;朱正华;朱萧玲;王强;吕岩;陈绍洋;;Electroacupuncture pretreatment induces the tolerance against focal cerebral ischemia through activation of Notch pathway[A];中华医学会第五次全国重症医学大会论文汇编[C];2011年

6 黄佳圆;王锐;陈龙邦;;Expression of Notch-1 and Its Clinical Significance in Different Histological Subtypes of Human Lung Adenocarcinoma[A];2013华东胸部肿瘤论坛暨第六届浙江省胸部肿瘤论坛论文集[C];2013年

7 ;Aberrant expression profile of Notch signaling pathway involved in immune thrombocytopenic purpura patients[A];第12届全国实验血液学会议论文摘要[C];2009年

8 ;Notch induced protein degradation in lymphoid development[A];第六届全国免疫学学术大会论文集[C];2008年

9 ;The functions of ptrl in Notch and Integrin pathways[A];2012全国发育生物学大会摘要集[C];2012年

10 Yaochun Wang;Guorui Dou;Lin Wang;Hua Han;;Notch signaling:licenses and limits cellular responses to extrinsic stimulations?[A];中国生物化学与分子生物学会第十届会员代表大会暨全国学术会议摘要集[C];2010年

相关重要报纸文章 前1条

1 ;为什么心在左肝在右？[N];新华每日电讯;2004年

相关博士学位论文 前10条

1 王凯;Notch信号在小鼠创伤性脑损伤后神经元死亡中的作用及机制研究[D];第四军医大学;2015年

2 陈娟娟;Notch重组配体D1R在促进造血重建中的作用与机理[D];第四军医大学;2015年

3 梁燕;Notch3对低氧诱导的人肺动脉平滑肌细胞增殖的作用机制探讨[D];首都医科大学;2014年

4 孙建华;肺癌患者在乏氧条件下VEGF和Dll4/Notch通路分子的异常表达和相互关系[D];山东大学;2015年

5 丁君;缺氧诱导因子1-α和Notch1的关系及其在阿尔茨海默病中的研究[D];华中科技大学;2015年

6 付伟;Notch信号在慢性粒细胞白血病细胞增殖和伊马替尼耐药的调控作用研究[D];第四军医大学;2014年

7 柏振江;Notch配体DLL4在手足口病患儿中表达、临床意义和功能分析[D];苏州大学;2016年

8 田z，

本文编号：1654229