急性髓系白血病TRAIL耐药相关microRNA分子的功能及作用机制研究

发布时间：2018-03-23 18:50

本文选题：miR-424　切入点：miR-27a　出处：《山东大学》2016年博士论文

【摘要】：研究背景：急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)是一类严重威胁人类健康的造血系统恶性疾患,具有高度异质性。AML以克隆性增殖的、异常分化的造血细胞在骨髓、外周血及其他组织中广泛浸润为特征,是最常见的成人急性白血病。近年来随着标准化疗及异基因造血干细胞移植的应用,AML患者的治疗效果得到明显改善,但化疗耐药、治疗相关死亡的发生仍使许多患者预后不良。因此,探索新的药物治疗方法十分关键。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis inducing ligand, TRAIL)是一种Ⅱ型跨膜蛋白,主要由免疫细胞表达,属于肿瘤坏死因子超家族成员。TRAIL通过与凋亡诱导受体TRAIL-R1和TRAIL-R2结合,激活内源性和外源性凋亡通路,可特异性地杀伤肿瘤细胞,而对正常细胞毒性较低,在肿瘤治疗中拥有良好的应用前景。报道显示,多数人类肿瘤原代细胞包括白血病细胞和肿瘤细胞系对TRAIL原发或继发耐药,极大程度限制了TRAIL的临床应用。已被报道的常见TRAIL耐药机制有：TRAIL与无功能的诱骗受体DcRl 和 DcR2结合,无法诱导细胞凋亡；细胞凋亡蛋白酶(Caspase)表达下调：凋亡诱导受体TRAIL-R1、TRAIL-R2功能失调；抗凋亡蛋白如Bcl2、Mcl-1、c-FLIP过表达等。然而,TRAIL耐药的发生机制仍有待进一步阐明。MicroRNA (miRNA)是一种长度为19-25个碱基的非编码小RNA,可通过与下游靶基因mRNA的3'UTR区结合引起其翻译抑制或mRNA降解,在转录或转录后水平发挥负性调控作用。多项研究表明,miRN A在细胞增殖、分化、凋亡、转移、血管新生及肿瘤发生中均发挥重要作用。同时,在多种造血系统恶性疾患中存在miRNA的差异表达,其表达异常参与恶性血液病的发生和化疗耐药过程。此外,Garofalo等新近报道,与低侵袭性的肿瘤或正常肺、肝组织相比,miR-221 222在侵袭性非小细胞肺癌和肝细胞肝癌中过表达,通过靶向抑癌基因PTEN 和 TIMP3促进肿瘤细胞TRAIL耐药。但是,miRNA分子是否参与AMLTRAIL耐药及其具体作用机制尚不明确。综上所述,筛选出在AML TRAIL耐药细胞中差异表达的niRNA分子,进一步探讨其参与AML细胞TRAIL耐药的分子机制,可为逆转AML TRAIL耐药提供新的分子靶点,为AML临床治疗提供新思路。研究目的：通过研究miRNA 在 AML TRAIL耐药细胞株中的表达,筛选出参与AML TRAIL耐药的miRNA分子,进一步探讨niRNA 在 AML TRAIL耐药中的作用及机制,为逆转AML TRAIL耐药提供新的靶点。研究方法：1.AML细胞株TRAIL敏感性检测：将AML细胞接种在96孔细胞培养板中,并加入0,20,50,100,200ng/ml的TRAIL培养48h。48h小时后每孔加入10ulCCK8,37度温箱避光孵育4h,酶标仪分别检测在450nm 和 650nm波长的吸光度,计算TRAIL对AML细胞的增殖抑制率和IC50值。2.标本采集：收集78例AML患者和10例正常对照的骨髓标本,其中AML患者分为62例初诊患者和16例完全缓解患者两组,有7对标本分别取自同一位AML患者初诊和完全缓解状态下。淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离单个核细胞,获得细胞团后加入1mlTRIzol吹打均匀,-80度冰箱冻存。3.实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)方法检测AML患者和AML细胞株中niR-424、miR-27a、PLAG1、Bcl2的表达水平。TRIzol提取细胞的总RNA, Taqman MicroRNA Reverse Transcription试剂盒特异性地将miR-424和miR-27a反转录为cDNA,应用Taqman荧光探针检测成熟]miR-424和miR-27a的表达水平。Takara反转录试剂盒将提取的总RNA反转录为cDNA,应用7900HT系统和SYBR Green Master Mix进行qRT-PCR实验,检测AML细胞中PLAG1和Bcl2的表达水平。4. miR-424、miR-27a,及PLAG1 在 AML TRAIL耐药中的功能研究4.1细胞转染：应用Lipofectamine 2000将终浓度50nM的miR-424模拟物(mimic)、miR-27a模拟物及对照的寡核苷酸(NC)转染AML TRAIL耐药细胞株K562、HL-60和NB4,48h后收集细胞,qRT-PCR法检测细胞miR-424和miR-27a的表达情况。同样方法转染PLAG1的小干扰RNA (siPLAG1)及其阴性对照,48h后qRT-PCR和Western Blot法检测AML细胞中PLAG1的表达。4.2 CCK8法检测TRAIL敏感性实验：将转染过miR-424/miR-27a模拟物或PLAG1小干扰RNA的AML细胞接种在96孔细胞培养板中,并加入0,20,50,100,200ng/ml或0,50,100,200,500ng/ml的TRAIL培养48h。48h小时后每孔加入10ul CCK8,37度温箱避光孵育4h,每孔加入100g1 10% SDS溶液,37度温箱孵育过夜,酶标仪分别检测在450nm和650nm波长的吸光度,计算TRAIL对AML细胞增殖抑制率和IC50值。4.3流式细胞术检测细胞凋亡：收集转染过miR-424/miR-27a模拟物或PLAG1小干扰RNA的AML细胞,1500rpm离心后弃去培养基,PBS洗涤两遍细胞,加入AnnexinV/PI流式抗体,避光孵育15min, Becton Dickinson FACS Calibur流式机器上机检测,计算凋亡细胞比例,每个实验至少收集10000个细胞。5. miR-42427a靶向PLAG1作用机制研究5.1生物信息学(TargetScan, Pictar)预测PLAG1可能为miR-424 和 miR-27a共同的下游靶基因,qRT-PCR 和 Western Blot检测分别改变niR-424 和 miR-27a的表达水平后PLAG1 mRNA和蛋白水平表达变化。5.2构建携带PLAG1 3'UTR区野生型和突变型的荧光素酶报告质粒,分别与miR-424、miR-27a及阴性对照共转染,检测niR-424 或 miR-27a 上调后,荧光素酶的活性变化,证实miR-424和miR-27a可直接调控PLAG1 3'UTR活性。5.3应用Lipofectamine 2000转染miR-424和miR-27a的模拟物或者PLAG1的小干扰RNA后,Western Blot检测TRAIL通路下游分子DR4、DR5、c-FLIP、Mcl-1、 CD44、Bcl2等的表达变化,寻找miR-424 和 miR-27a通过靶向PLAG1影响TRAIL耐药的下游机制。5.4加入200ng/ml TRAIL作用于上调niR-424/miR-27a或下调PLAG1后的K562细胞3h,分为加药组和空白组,Western Blot检测Caspase3, Caspase8, PARP等凋亡通路分子的表达变化。5.5质粒构建及慢病毒包装：获取Hela细胞的基因组cDNA, PCR扩增PLAG1的CDS片段,连接至p3xFLAG-CMV-10载体的KpnI和XbaI两个酶切位点之间,构成PLAG1的过表达质粒。以Bc12过表达质粒Bcl2-pCEP4为模板,PCR扩增Bc12的CDS片段,插入到pLenti-C-GFP载体中,构成pLenti-C-GFP-Bcl2质粒。10ug pLenti-C-GFP-Bcl2质粒与6.67ug psPAX2 和 3.3ug pMD2.G病毒包装质粒共转染293T细胞,可获得过表达Bcl2的慢病毒颗粒。5.6 PLAG1对下游分子Bc12的作用机制研究：将PLAG1过表达质粒p3xFLAG-CMV-10-PLAG1与含有Bc12启动子全长的荧光素酶报告质粒LB322共转染293T细胞,双荧光素酶报告实验检测上调PLAG1后荧光素酶活性变化。p3xFLAG-CMV-10-PLAG1质粒转染293T细胞,qRT-PCR检测Bcl2 mRNA表达变化。5.7细胞分组如下：①转染miR-424 mimic+Bcl2上调组；②转染miR-27a mimic+Bcl2上调组；③转染niR-NC+Bcl2上调组；④转染miR-424 mimic+感染Lenti-C-GFP病毒组；⑤转染niR-27a mimic+感染Lenti-C-GFP病毒组；⑥转染miR-NC+感染Lenti-C-GFP病毒组；⑦转染siPLAG1+Bcl2上调组；⑧转染siNC+Bcl2上调组；⑨转染siPLAG1+感染Lenti-C-GFP病毒组；⑩转染siNC+感染Lenti-C-GFP病毒组。以上10组细胞在转染后48h加或不加入200ng/mlTRAIL继续处理48h,CCK8检测细胞活性。6.统计分析：每个实验均重复至少三次,每个数据均以mean+/-S.E.的形式表示。实验组与对照组之间的差异检测才用Student's t检验。临床标本的数据分析才用Mann-Whitney检验。所有数据分析均用SPSS (version 17.0)进行。p0.05被认为具有统计学意义。研究结果：1.AML细胞株的TRAIL敏感性检测：AML细胞株HL-60、HL-60/ADM、K562、 K562/A02和NB4对TRAIL的IC50值分别为699.34 ng/ml,76.71 ng/ml,2057.05 ng/ml,333.70 ng/ml和476.33 ng/ml。我们将其分为TRAIL耐药细胞株(K562)、TRAIL部分耐药细胞株(HL-60、K562/A02、NB4)和TRAIL敏感细胞株(HL-60/ADM)三组。2. miR-424、miR-27a和PLAG1在AML细胞株中的表达水平2.1 miR-424和miR-27a在TRAIL耐药细胞株中显著下调而在TRAIL敏感株中上调。部分耐药的HL-60和NB4细胞miR-424和miR-27a的表达处于中等水平。尽管K562/A02对TRAIL部分耐药,其miR-424和miR-27a的表达水平仅略高于K562细胞。2.2 PLAG1的表达在TRAIL耐药细胞株(K562)和部分耐药细胞株(HL-60、NB4)中较TRAIL敏感细胞株(HL-60/ADM)显著上调。尽管K562/A02对TRAIL中等敏感,其PLAG1的表达水平仅略低于K562细胞。3. miR-424、miR-27a、PLAG1和Bcl2在AML患者中的表达水平3.1来自同一AML患者初诊时和完全缓解时的骨髓标本相比,完全缓解时其骨髓细胞miR-424和miR-27a的表达水平上调。3.2 PLAG1在AML初诊患者中的表达水平较完全缓解患者和正常对照显著上调。来自同一AML患者初诊时和完全缓解时的骨髓标本相比,完全缓解时其骨髓细胞PLAG1的表达水平下调。3.3 Bc12在AML初诊患者中的表达水平较完全缓解患者和正常对照显著上调。来自同一AML患者初诊时和完全缓解时的骨髓标本相比,完全缓解时其骨髓细胞Bc12的表达水平下调。4. miR-424、miR-27a 和 PLAG1 在 AML TRAIL耐药中的作用4.1 qRT-PCR结果证实,转染miR-424 mimic 和 miR-27a mimic 后, AML细胞中miR-424和miR-27a的表达水平显著上调。4.2 qRT-PCR和、Western Blot检测显示,转染PLAG1小干扰RNA后,AML细胞中PLAG1表达显著下调。4.3 miR-424,miR-27a和PLAG1的表达变化对AML细胞TRAIL敏感性的影响：CCK8检测显示上调miR-424、miR-27a或者下调PLAG1后,可显著增强由TRAIL诱导的AML细胞增殖抑制；流式细胞术检测细胞凋亡显示上调miR-424、miR-27a或者下调PLAG1可显著增加由TRAIL诱导的AML细胞凋亡。5. miR-42427a靶向PLAG1作用机制研究5.1生物信息学网站(。TargetScan、Pictar)预测PLAG1为miR-424和miR-27a共同的下游靶基因。有效上调AML细胞中miR-424和miR-27a的表达后,PLAG1的mRNA表达无明显改变,蛋白表达显著下调。5.2双荧光素酶报告实验显示,miR-424和miR-27a可直接抑制PLAG1 3'UTR活性,在3'UTR的结合位点引入突变后,可阻断miR-424和miR-27a对荧光素酶活性的抑制作用,证实miR-424和miR-27a可直接与PLAG1的3'UTR结合,负性调控其活性。5.3上调niR-424和miR-27a或下调PLAG1的表达后,DR4、DR5、cFLIP、Mcl-1、 CD44、TRAF2等TRAIL凋亡相关分子的表达无明显改变,但Bc12表达水平显著下调。5.4上调miR-424和miR-27a或下调PLAG1表达后,可显著增强TRAIL诱导的Caspase3.Caspase8和PARP的激活。5.5上调PLAG1后可显著增强Bc12启动子活性从而激活Bc12转录,上调其mRNA表达水平。5.6 Western Blot证实感染Bcl2-Lenti-C-GFP慢病毒后,K562细胞中Bc12的表达水平显著上调。上调Bc12后,可削弱上调miR-424、miR-27a或者下调PLAG1对AML细胞的TRAIL增敏作用。结论：1.miR-424和miR-27a在AML TRAIL耐药和敏感细胞株中差异表达,提示miR-424和miR-27a可参与AML TRAIL耐药过程。2.miR-424和miR-27a通过靶向PLAG1增强AML细胞对TRAIL的敏感性。3.PLAG1通过转录激活Bc12发挥抗凋亡作用,即同时干扰内源性和外源性凋亡通路,阻断Caspase3、Caspase8和PARP的激活。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.71

【相似文献】