胃癌细胞中miR-520d-5p的功能研究
本文选题：miR-520d-5p 切入点：人胃癌细胞 出处：《广东药学院》2015年硕士论文
【摘要】：目的高通量筛选胃癌组织中异常表达的mi RNAs,选择在胃癌组织中高表达的mi RNA-520d-5p,并探讨其对人胃癌细胞增殖、迁移和侵袭方面的作用。方法从3对手术切除的胃癌组织和配对的癌旁正常胃组织中提取总RNA,mi RNA芯片分析法检测mi RNA表达水平,然后在47例相互配对的胃癌和癌旁正常胃组织标本中,用实时荧光定量PCR(Real-time RT-PCR,Taqman法)对部分差异表达的mi RNA进行验证。利用脂质体在胃癌细胞系AGS和HGC-27中瞬时转染mi R-520d-5p inhibitor(mi R-520d-5p抑制剂)以降低mi R-520d-5p的表达水平,mi R-520d-5p inhibitor negative control(mi R-520d-5p抑制剂阴性对照)组做阴性对照组(简称NC组)。转染48h后,Real-time RT-PCR检测转染后各组细胞系中mi R-520d-5p的表达水平。WST-1实验和细胞克隆形成实验检测胃癌细胞的增殖能力,流式细胞术检测细胞周期变化,细胞划痕实验和transwell迁移实验检测细胞的迁移能力,transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力。结果1.mi RNA芯片分析结果显示:与配对的正常胃组织相比,有62个mi RNAs在胃癌组织中异常表达,其中42个mi RNA高表达,20个mi RNA低表达。2.Real-time RT-PCR结果显示:mi R-520d-5p在胃癌组织中表达显著提高(P=0.032)。3.转染mi R-520d-5p inhibitor后,Real-time RT-PCR检测AGS和HGC-27中mi R-520d-5p表达水平,结果显示:与阴性对照组比较,mi R-520d-5p的表达分别降低了62倍(P0.001)和88倍(P0.001)。以上结果表明:通过瞬时转染mi R-520d-5p inhibitor可有效下调mi R-520d-5p在胃癌细胞系中的表达水平。4.WST-1实验显示在AGS和HGC-27细胞中降低mi R-520d-5p的表达96h后,与对照相比细胞生长速度均明显减慢,分别降低35.08%(F=51.496,P0.001;和21.03%F=56.689,P0.001)。细胞克隆形成实验结果显示AGS/NC组克隆形成数为137.7+13.1个,实验组AGS/mi R-520d-5p inhibitor克隆形成数为56.7+8.5个,差异有统计学意义(t=9.006,P=0.001);HGC-27NC组克隆形成数为111.7+10.0个,实验组HGC-27/mi R-520d-5p inhibitor克隆形成数为58.3+5.5个,差异有统计学意义(t=8.081,P=0.001)。以上结果表明:降低mi R-520d-5p的表达水平能抑制胃癌细胞的增殖和克隆形成能力。5.流式细胞仪分析细胞周期分布结果显示,与NC组相比,降低mi R-520d-5p表达后,AGS和HGC-27细胞S期细胞数分别增加11.88%(T=-20.193,P0.001)和13.94%(T=-6.578,P=0.003)。6.Tranwell侵袭实验显示:阴性对照组AGS/negative control穿膜细胞数为353.3±22.0个,实验组AGS/mi R-520d-5p inhibitor穿膜细胞数为个148.0±8.5,差异有统计学意义(t=-15.051,p0.001);阴性对照组HGC-27/negative control穿膜细胞数为336.7±12.1个,实验组HGC-27/mi R-520d-5p inhibitor穿膜细胞数为224.3±17.5个,差异有统计学意义(t=-9.155,p=0.001)。以上结果表明:降低mi R-520d-5p表达水平可以抑制胃癌细胞的侵袭能力。7.Tranwell迁移实验显示:AGS/NC组穿膜细胞数为382.0±12.1个,AGS/mi R-520d-5p inhibitor组穿膜细胞数为个189.3±19.6,差异有统计学意义(t=-14.464,p0.001);HGC-27/NC组穿膜细胞数为400.0±19.1个,HGC-27/mi R-520d-5p inhibitor组穿膜细胞数为215.3±16.6个,差异有统计学意义(t=-12.660,p=0.001)。以上结果表明:降低mi R-520d-5p表达水平可以抑制胃癌细胞的迁移能力。8.细胞划痕实验显示:AGS和HGC-27划痕24h后mi RNA-520d-5p抑制表达实验组细胞愈合率分别为12.24%±1.6%和9.74%±1.6%,与阴性对照组19.77%±1.4%和45.22%±4.0%比较,P0.05,实验具显著性差异。AGS和HGC-27划痕48h后mi RNA-520d-5p抑制表达实验组细胞愈合率分别为32.82%±1.2%和40.46%±1.2%,与阴性对照组42.79%±3.3%和67.58%±2.1%比较P0.05,实验具有显著性差异。结论1.mi R-520d-5p在胃癌组织中表达水平显著高于正常胃组织。2.降低胃癌细胞中mi R-520d-5p的表达水平,可以抑制胃癌细胞的增殖,迁移,侵袭能力,并在S期对细胞周期有阻滞作用。
[Abstract]:The purpose of high-throughput screening of abnormal expression of MI in gastric cancer RNAs, high expression of MI in gastric cancer RNA-520d-5p, and explore the proliferation of human gastric cancer cell migration and invasion method from 3 aspects of the role. The resected gastric cancer tissues and adjacent normal gastric tissue total RNA extraction, analysis mi RNA Mi chip to detect the expression level of RNA, and then pairing in 47 cases of gastric carcinoma and adjacent normal gastric tissues by real-time fluorescence quantitative PCR (Real-time RT-PCR Taqman) to verify the MI RNA part of differential expression. By liposome in AGS HGC-27 and R-520d-5p inhibitor in transiently transfected Mi gastric cancer cells the Department (MI R-520d-5p inhibitor) to reduce the expression level of MI R-520d-5p, MI R-520d-5p inhibitor negative control (MI inhibitor R-520d-5p negative control group) negative control group (NC group). After transfection of 48h, Real-tim E RT-PCR detection of transfected cell lines were mi R-520d-5p.WST-1 expression level and cell clone formation experiment of gastric cancer cell proliferation assay, cell cycles were determined by flow cytometry, cell migration scratch assay and Transwell migration assay and cell invasion assay, Transwell cells. The results of the analysis results of 1.mi RNA chip display: compared with normal gastric tissue matching, abnormal expression of 62 mi RNAs in gastric cancer, the high expression of MI 42 RNA, 20 mi RNA low expression of.2.Real-time RT-PCR showed that the expression of MI R-520d-5p in gastric cancer tissues increased significantly (P=0.032).3. mi R-520d-5p inhibitor after transfection, the level of MI, R-520d-5p the expression of Real-time RT-PCR and HGC-27 AGS detection results showed that: compared with the control group, the expression of MI R-520d-5p decreased 62 times (P0.001) and 88 times (P0.0 01). The above results show that the transient transfection of MI R-520d-5p inhibitor showed effective down-regulation of MI R-520d-5p in gastric cancer cell lines in the expression level of.4.WST-1 decreased expression of 96h mi R-520d-5p experiment in AGS and HGC-27 cells, compared with the control cell growth speed was significantly slowed down and reduced 35.08% respectively (F=51.496, P0.001; and 21.03%F=56.689, P0.001). Cell clone formation assay showed that the AGS/NC group the number of colonies formed into 137.7+13.1, experimental group AGS/mi R-520d-5p inhibitor clone number is 56.7+8.5, the difference was statistically significant (t= 9.006, P=0.001); group HGC-27NC clone number is 111.7+10.0, R-520d-5p inhibitor HGC-27/mi in the experimental group the number of colonies formed into 58.3+5.5. The difference was statistically significant (t=8.081, P=0.001). The above results show that reduced proliferation and cloning expression of MI R-520d-5p can inhibit the formation of gastric cancer cells Analysis of cell cycle distribution results showed that the ability of.5. flow cytometry, compared with NC group, MI decreased the expression of R-520d-5p, AGS and HGC-27 cells in S phase cells were increased by 11.88% (T=-20.193, P0.001) and 13.94% (T=-6.578, P=0.003).6.Tranwell invasion assay showed: negative control group AGS/negative control transmembrane cell number was 353.3. 22, the experimental group AGS/mi R-520d-5p inhibitor transmembrane cell number was 148 + 8.5, the difference was statistically significant (t=-15.051, p0.001); negative control group HGC-27/negative control transmembrane cell number was 336.7 + 12.1, the experimental group HGC-27/mi R-520d-5p inhibitor transmembrane cell number was 224.3 + 17.5, the difference was statistically significant (t=-9.155, p=0.001). The above results show that MI reduced the expression level of R-520d-5p can inhibit the invasive ability of gastric cancer cells.7.Tranwell migration assay showed that: AGS/NC cells was 382 + 12.1 AGS/mi, R-520d-5p inhibitor cells was 189.3 + 19.6, the difference was statistically significant (t=-14.464, p0.001); HGC-27/NC cells was 400 + 19.1, HGC-27/mi R-520d-5p inhibitor cells was 215.3 + 16.6, the difference was statistically significant (t=-12.660, p=0.001). The above results showed that the migration ability of.8. cells to reduce the expression level of R-520d-5p Mi scratch test can inhibit gastric cancer cells: expression of cells in the experimental group the healing rate were 12.24% + 1.6% and 9.74% + 1.6% mi RNA-520d-5p AGS and HGC-27 24h after inhibition of scratch, the control group of 19.77% + 1.4% and 45.22% + 4%, and P0.05 negative and significant experiment the difference between.AGS and HGC-27 after 48h mi RNA-520d-5p inhibits the expression of wound healing rate of cells in the experimental group were 32.82% + 1.2% and 40.46% + 1.2%, 42.79% + 3.3% and 67.58% + group 2.1% P0.05 compared with the negative control, experiment Conclusion the expression level of 1.mi R-520d-5p in gastric cancer tissue is significantly higher than that in normal gastric tissue.2., and the expression level of MI R-520d-5p in gastric cancer cells can inhibit the proliferation, migration and invasion ability of gastric cancer cells, and block cell cycle in S stage.
【学位授予单位】：广东药学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.2
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，本文编号：1657226
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