三氧化二砷的抗血管作用对小细胞肺癌转移的影响

发布时间：2018-03-27 12:41

本文选题：SCLC　切入点：三氧化二砷　出处：《第二军医大学》2017年硕士论文

【摘要】：研究背景及目的肺癌是当今社会对人类健康及生命威胁最大的恶性肿瘤之一,在世界范围内,每年有超过120万肺癌新发患者,死亡患者约110万人。小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)是一种恶性程度较高的肺癌类型,在肺癌中所占的比例约为15%至20%。SCLC属于未分化癌,生长迅速,较早出现淋巴道转移和侵入血管转移到远处器官,在各类肺癌中,其预后最差。患者两年生存率小于5%。恶性肿瘤的转移是其明显区别于其它疾病的特异性标志。事实上,多数晚期恶性肿瘤患者的死因都是由肿瘤的转移引起。从这个角度来说,如果能抑制肿瘤的侵袭和转移,就能在很大程度上降低肿瘤患者的死亡率,延长患者生存期。在目前的医疗条件下,SCLC的早期诊断率低,许多患者在初诊即已发生转移,失去了手术机会,而化疗、放疗的疗效并不理想,且SCLC尚缺乏有效的靶向治疗药物,长期以来,SCLC患者的生存率一直无明显提高。在这种情况下,我们亟需找到有效治疗SCLC的新方法,而针对SCLC早期转移的控制正是一个研究突破口。三氧化二砷(arsenic trioxide,As_2O_3)最初在我国被用于白血病的治疗,对急性早幼粒细胞白血病表现出良好的治疗效果。在实体肿瘤中,陆续有多项临床和基础研究证明其亦具有治疗作用。在As_2O_3对实体瘤的作用中,肝癌领域研究较早且进展最快,研究发现As_2O_3在细胞水平、动物水平和人体内都表现出了对肝癌的抑制作用。到目前为止,我国FDA已批准As_2O_3在急性早幼粒细胞白血病和晚期肝癌这两种疾病的临床应用。本人所在课题组既往研究证实,As_2O_3对肺癌亦具有抑制作用。在细胞层面,发现其可以使肺癌细胞的细胞周期停滞,诱导肺癌细胞凋亡,使其增殖受到明显抑制;在体内水平,我们发现As_2O_3可以抑制裸鼠NSCLC和SCLC皮下移植瘤的生长,对SCLC的抑制作用尤为明显,其机制可能是通过抑制VEGF和Dll4-Notch通路,从而阻断肺癌血供。在临床研究中,我们发现As_2O_3对肺癌胸膜转移引起的恶性胸腔积液具有良好的治疗效果。然而,As_2O_3对处于肺癌进展关键地位的肿瘤转移过程是否具有直接抑制或阻断作用尚缺乏有力证据,对VEGF通路下游位于血管内皮细胞内部发生的信号调控机制也尚未明确,本研究的目的即是探讨As_2O_3对SCLC在体内转移的作用及其可能机制。实验方法第一部分三氧化二砷对脐静脉内皮细胞增殖和迁移的影响一、三氧化二砷对脐静脉内皮细胞增殖的影响将对数生长期的脐静脉内皮细胞混匀后加入96孔板,待细胞生长稳定后分别予0、0.5、1、2、4和8μmol/L的As_2O_3干预细胞24小时、48小时、72小时,CCK8试剂盒检测细胞增殖活性。二、三氧化二砷对脐静脉内皮细胞迁移的影响将静脉内皮细胞培养至对数生长期,胰酶消化,然后用无血清培养基重悬、计数,以5×104/孔接种于已铺上基质胶的transwell小室的上室,另外含20%胎牛血清的完全培养基加入下室,培养24小时后结束实验,在染色后于显微镜下进一步观察记录。三、三氧化二砷对脐静脉内皮细胞迁移相关分子DSCR1等表达的影响用0、2、4μmol/L的As_2O_3及1μmol/L的环孢素A干预静脉内皮细胞内72h后,进行q PCR、Western blot检测DSCR1、NFAT2、Calcineurin A、CXCR7、RND1在m RNA和蛋白水平的表达。第二部分三氧化二砷在动物模型中对小细胞肺癌转移的抑制作用一、构建裸鼠人源性SCLC转移模型将人源性SCLC肺癌细胞株H446培养至对数生长期,胰酶消化后用生理盐水将细胞重悬计数,将2×106个H446细胞经尾静脉注射入5周龄的裸鼠,观察裸鼠的状态,在第35天将动物安乐死,活体解剖拍照观察肝、肺肿瘤生长情况,HE染色镜下观察转移情况。二、三氧化二砷在裸鼠体内对SCLC转移的抑制作用构建肺癌裸鼠转移模型24只,分4组,第一组每天腹腔注射生理盐水作为对照,第二、三组分别每天腹腔注射2.5mg/kg/d、5mg/kg/d As_2O_3,第四组隔天一次腹腔注射环孢素A 20mg/kg/d,以上各组均干预10天,10天后活体解剖、HE染色观察肝肺肿瘤转移情况。研究结果第一部分三氧化二砷对脐静脉内皮细胞增殖和迁移的影响一、三氧化二砷对脐静脉内皮细胞增殖的影响干预24小时,As_2O_3对脐静脉内皮细胞的抑制与对照组相比差异无统计学意义(p0.05)。干预48小时,各个浓度组As_2O_3都可以抑制细胞的增殖,其中0.5μM、4μM、8μM组较对照组比较有统计学意义(P0.05),且随着药物浓度的提高,抑制的趋势更加明显,干预72小时,各个浓度组As_2O_3都可以抑制细胞的增殖,其中2μM、4μM、8μM组较对照组比较有统计学意义(P0.05),且随着药物浓度的提高,抑制的趋势更加明显。二、三氧化二砷对脐静脉内皮细胞迁移的影响As_2O_3对脐静脉内皮细胞迁移有明显的抑制作用,在As_2O_3 2μM和4μM组,静脉细胞内皮迁移的数量显著低于对照组(p0.05),且高浓度组(4μM组)较低浓度组(2μM)下降的更加明显(p0.05),另有环孢素A组细胞迁移的数量较对照组也下降(p0.05)。其中As_2O_3 4μM组较环孢素A组下降更加明显(p0.01)。三、三氧化二砷对脐静脉内皮细胞迁移相关分子DSCR1等表达的影响利用q PCR和Western blot分别从m RNA和蛋白水平证明,As_2O_3能够上调DSCR1的表达,下调NFAT2、Calcineurin A、CXCR7、RND1分子的表达。第二部分三氧化二砷在动物模型中对小细胞肺癌转移的抑制作用一、构建裸鼠人源性SCLC转移模型成功构建裸鼠肺癌转移模型,在裸鼠尾静脉注入肺癌H446细胞35天后活体解剖发现肝脏、肺部肿瘤结节,HE染色镜下可见肝脏、肺部有肿瘤组织。二、三氧化二砷在裸鼠体内对SCLC转移的抑制作用As_2O_3可以抑制H446细胞在裸鼠体内的转移,并且随着As_2O_3浓度的提高,抑制作用更加明显。在转移肿瘤结节数量上,发现As_2O_3 2.5mg和5mg组及环孢素A组肝脏的转移结节较生理盐水对照组都减少(分别为P0.01,P0.01,P0.05),但2.5mg与5mg组间对比无明显差别(P0.05)。在转移肿瘤面积上,发现As_2O_3 2.5mg组肝脏转移面积较对照组减少(P0.05),As_2O_3 5mg组及环孢素A组与生理盐水对照组比无统计学差异。(p0.05)结论1、As_2O_3对人脐静脉内皮细胞的增殖和迁移有抑制作用;2、As_2O_3能调控VEGF通路在血管内皮细胞内部的承接信号因子,包括上调DSCR1,下调NFAT2、Calcineurin A及其下游因子CXCR7、RND1等因子;3、As_2O_3在裸鼠体内能抑制SCLC的转移;4、As_2O_3可能通过抑制血管形成来抑制SCLC的转移。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R734.2

【参考文献】