β-hCG促进人卵巢癌侵袭转移的体内研究

发布时间：2018-03-27 19:36

本文选题：人上皮性卵巢癌　切入点：β-hCG　出处：《石河子大学》2017年硕士论文

【摘要】：目的:研究人绒毛膜促性腺激素β亚基(β-hCG)对上皮性卵巢癌侵袭转移的调控作用。方法:1、携带目的基因β-hCG和报告基因GFP的慢病毒以及对照慢病毒分别感染上皮性卵巢癌细胞株SKOV-3和ES-2,建立β-hCG稳定过表达实验组细胞SKOV-3 lv-β-hCG和ES-2 lv-β-hCG以及对照组细胞SKOV-3 lv-con和ES-2 lv-con。qRT-PCR和western blot方法分别检测目的基因的表达情况。采用单样本t检验分析过表达细胞株SKOV-3lv-β-hCG和ES-2 lv-β-hCG以及对照组细胞SKOV-3 lv-con和ES-2 lv-con之间β-hCG的表达差异。2、取4-6周龄雌性裸鼠,将实验组细胞SKOV-3 lv-β-hCG和ES-2 lv-β-hCG以及对照组细胞SKOV-3 lv-con和ES-2 lv-con,分别用胰岛素针从裸鼠右下腹部移植入裸鼠腹腔,构建腹腔移植瘤模型。每只裸鼠腹腔移植细胞数量为2×107个细胞,细胞悬液总体积为200uL。每组实验裸鼠6只,共24只。术后未发生手术原因死亡,每隔3天观察裸鼠一般状态,并记录裸鼠体重变化。每周1次用活体成像系统观察各组肿瘤细胞在裸鼠腹腔内的成瘤及转移情况。根据裸鼠状态在腹腔移植术后第4-6周解剖裸鼠,全面解剖裸鼠盆腹腔脏器及胸腔双肺组织,记录腹水量及性状;观察并记录肿瘤形成、形态、浸润及转移情况,计算腹腔成瘤数(2mm);取部分组织液氮冻存备用,另一部分用中性甲醛固定、石蜡包埋后切片、HE染色镜下观察其细胞形态、组织学分型。western blot检测两组肿瘤的β-hCG表达情况,采用单样本t检验分析。两组的腹水,体重,成瘤数以及转移灶个数的对比用两独立样本t检验,以P0.05为差异有统计学意义。3、取4-6周龄雌性裸鼠,将实验组细胞SKOV-3 lv-β-hCG和ES-2 lv-β-hCG以及对照组细胞SKOV-3 lv-con和ES-2 lv-con,用显微注射法在裸鼠一侧卵巢进行显微多点注射,构建卵巢原位移植瘤模型。每只裸鼠卵巢移植细胞数量为5×105个细胞,细胞悬液总体积为5uL。每组实验裸鼠6只,共24只。术后未发生手术原因死亡,每隔3天观察裸鼠一般状态,并记录裸鼠体重变化。每周1次用活体成像系统观察各组肿瘤细胞在裸鼠腹腔内的成瘤及转移情况。根据裸鼠状态在原位移植术后第6周解剖裸鼠,全面解剖裸鼠盆腹腔脏器及胸腔双肺组织,记录腹水量及性状;观察并记录肿瘤形成、形态、浸润及转移情况,计算卵巢原位成瘤体积大小Volume=(长径×短径2)/2,计算腹腔成瘤数;留取裸鼠卵巢肿瘤组织,取部分组织液氮冻存备用,另一部分用中性甲醛固定、石蜡包埋后切片、HE染色镜下观察其细胞形态、组织学分型。western blot检测两组肿瘤的β-hCG表达情况,采用单样本t检验分析。两组的裸鼠体重,卵巢原位成瘤体积大小以及转移灶个数的对比用两独立样本t检验,以P0.05为差异有统计学意义。结果:1、成功构建β-hCG过表达的SKOV-3和ES-2细胞株倒置荧光显微镜下观察,各组细胞的绿色荧光蛋白(GFP)的表达效率约为95%。qRT-PCR检测β-hCG的表达率,SKOV-3 lv-β-hCG比SKOV-3 lv-con提高了21283倍;ES-2 lv-β-hCG比ES-2 lv-con提高了72.33倍,统计结果均有显著差异(P0.01)。western blot检测β-hCG的表达水平,SKOV-3 lv-β-hCG比SKOV-3 lv-con提高了5.6倍;ES-2 lv-β-hCG比ES-2 lv-con提高了4.6倍,统计结果均有显著差异(P0.01)。2、成功构建了裸鼠卵巢癌腹腔移植瘤动物模型,并在此基础上证实β-hCG促进了裸鼠卵巢癌腹腔移植瘤的侵袭转移。腹腔移植瘤术后裸鼠皮肤干燥,活动明显减少、消瘦、行动迟缓、体重增加减缓以及腹水等恶病质情况。借助活体成像系统计算各组荧光值,实验组SKOV-3 lv-β-hCG和ES-2 lv-β-hCG组均高于对照组SKOV-3 lv-con组和ES-2 lv-con组。其中,SKOV-3 lv-con组(46.88±8.23),SKOV-3 lv-β-hCG组(114.6±7.42),两组荧光值差异具有统计学意义(P0.001)。ES-2 lv-con组(20.33±5.292),ES-2 lv-β-hCG组(79.81±4.05),两组荧光值差异有统计学意义(P0.001)。比较SKOV-3 lv-con组和SKOV-3 lv-β-hCG组裸鼠腹腔移植瘤模型后体重,两组体重分别为SKOV-3 lv-con(18.61±0.54)和SKOV-3 lv-β-hCG(18.37±0.27),差异无统计学意义。解剖裸鼠腹腔观察,两组肿瘤形成率均为100%。分别只有2只裸鼠有少量腹水形成,均为2/6。比较两组肿瘤转移灶个数,SKOV-3 lv-con(3.50±0.22)和SKOV-3lv-β-hCG(6.17±0.79),有统计学意义(P0.05)。再比较两组肿瘤形成个数,SKOV-3lv-con(24.67±1.09)和SKOV-3 lv-β-hCG(48.17±3.75),有统计学意义(P0.05)。比较ES-2 lv-con组和ES-2 lv-β-hCG组裸鼠腹腔移植瘤模型后体重,两组体重分别为ES-2 lv-con(17.69±0.33)和ES-2 lv-β-hCG(17.83±0.51),差异无统计学意义。解剖裸鼠腹腔观察,两组肿瘤形成率和腹水形成率均为100%,腹水呈乳糜样。取腹水细胞涂片,行HE染色进行形态学鉴定。测量比较两组腹水体积,ES-2 lv-con组为(1.07±0.06)、ES-2 lv-β-hCG组为(1.09±0.05),两组差异无统计学意义。比较两组肿瘤转移灶个数,ES-2 lv-con(3.67±0.33)和ES-2 lv-β-hCG(6.33±0.92),有统计学意义(P0.05)。再比较两组肿瘤形成个数,ES-2 lv-con(33.00±0.93)和ES-2 lv-β-hCG(58.33±2.50),有统计学意义(P0.05)。3、成功构建了卵巢癌裸鼠卵巢原位移植瘤动物模型,并在此基础上证实β-hCG促进了裸鼠卵巢癌原位移植瘤的侵袭转移。卵巢原位移植瘤术后裸鼠出现皮肤干燥,活动明显减少、消瘦、行动迟缓、体重增加减缓等恶病质情况。借助活体成像系统计算各组荧光值,实验组SKOV-3 lv-β-hCG组和ES-2 lv-β-hCG组均高于对照组SKOV-3lv-con组和ES-2 lv-con组。其中,SKOV-3 lv-con组(42.18±16.14),SKOV-3 lv-β-hCG组(94.76±15.24),两组荧光值差异具有统计学意义(P0.001)。ES-2 lv-con组(23.56±3.60),ES-2 lv-β-hCG组(97.04±8.26)。两组荧光值差异有统计学意义(P0.001)。比较SKOV-3 lv-con组和SKOV-3 lv-β-hCG组裸鼠原位移植瘤模型后体重,两组体重分别为SKOV-3 lv-con(19.20±0.41)和SKOV-3 lv-β-hCG(18.94±0.26),无统计学意义。解剖裸鼠腹腔观察,两组肿瘤形成率均为100%,均无腹水形成。比较两组肿瘤转移灶个数,SKOV-3 lv-con(2.33±0.21)和SKOV-3 lv-β-hCG(4.33±0.76),有统计学意义(P0.05)。再比较两组卵巢原位成瘤体积,SKOV-3 lv-con(2.57±0.25)和SKOV-3lv-β-hCG(2.93±0.32),两组差异无统计学意义。比较ES-2 lv-con组和ES-2 lv-β-hCG组裸鼠原位移植瘤模型后体重,两组体重分别为ES-2 lv-con(18.04±0.24)和ES-2 lv-β-hCG(18.53±0.45),两组差异无统计学意义。解剖裸鼠腹腔观察,两组肿瘤形成率均为100%,分别有两只裸鼠有少量透明腹水形成。比较两组肿瘤转移灶个数,ES-2 lv-con(2.50±0.22)和ES-2 lv-β-hCG(4.67±0.80),有统计学意义(P0.05)。再比较两组卵巢原位成瘤体积,ES-2 lv-con(2.56±0.25)和ES-2 lv-β-hCG(2.71±0.29),两组差异无统计学意义。4、western blot检测腹腔移植瘤模型中SKOV-3 lv-β-hCG组比SKOV-3 lv-con组提高了3.1倍;ES-2 lv-β-hCG组比ES-2 lv-con组提高了2.4倍。卵巢原位移植瘤模型中SKOV-3 lv-β-hCG组比SKOV-3 lv-con组提高了2.9倍;ES-2 lv-β-hCG组比ES-2 lv-con组提高了1.4倍,统计结果均有显著差异(P0.01)。5、病理学检测腹腔移植瘤模型及卵巢原位移植瘤模型的卵巢成瘤和各转移灶组织行HE染色。显微镜观察可见正常的卵巢上皮细胞已经被肿瘤细胞替代,原位成瘤与转移灶肿瘤成片块状弥漫分布或排列成团状,细胞核大且深染,细胞分化程度低。SKOV-3细胞模型构建的卵巢和转移瘤组织,HE染色观察病理特征符合人卵巢浆液性腺癌;ES-2细胞模型构建的卵巢和转移瘤组织,HE染色观察病理特征符合人卵巢透明细胞癌。结论:1、腹腔注射2×107个携带GFP的EOC细胞模型,可成功构建可动态检测的裸鼠腹腔移植瘤模型,该模型能够充分模拟卵巢癌腹腔播种移植的生物学特征,适宜作为研究人卵巢癌腹腔种植演变的体内模型。2、异氟烷吸入麻醉、从背部正中纵切口进入腹腔、显微多点注射法移植携带GFP的EOC细胞模型,能成功构建可动态监测的裸鼠卵巢原位移植瘤动物模型;该动物模型与人卵巢癌生物学特征类似,适宜作为研究人卵巢癌演变进展的体内模型。3、β-hCG能促进人上皮性卵巢癌细胞的侵袭转移能力。
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【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.31

【参考文献】