食管鳞癌侵袭转移相关分子靶标的筛选和功能研究
发布时间：2018-03-28 04:00
本文选题：食管鳞状细胞癌 切入点：侵袭转移 出处：《新疆医科大学》2017年博士论文
【摘要】：目的:1)建立不同侵袭转移潜能人食管鳞癌细胞亚系,用基因芯片筛选差异基因,建立食管鳞癌侵袭转移相关基因表达谱;2)验证部分差异基因在不同侵袭转移潜能食管鳞癌细胞和组织的表达,探讨HSP90α、Annexin A1和14-3-3β在新疆哈萨克族食管鳞癌的表达和病理意义;3)研究HSP90AA1沉默对食管鳞癌细胞生物学行为的影响和机制。方法:1)采用Transwell侵袭小室对Eca109母系(Eca109-T0)进行筛选,建立高侵袭转移潜能食管鳞癌细胞亚系Eca109-T4;体、内外比较Eca109-T0、Eca109-T4、CE81T-0和CE81T-4各系ESCC迁移和增殖能力;以Eca109-T0和Eca109-T4为对象,提取总RNA,分别用Cy5和Cy3荧光标记成cDNA探针,与基因芯片Affymetrix Gene Chip?Human Genome U133 Plus 2.0 Arry杂交,筛选出不同侵袭转移潜能食管鳞癌差异表达基因;对差异基因进行GO和KEGG聚类分析;2)采用qRT-PCR、Western blot和免疫组化验证部分差异基因表达;在细胞水平验证基因(HSP90AA1、ANXA1、YWHAB、CXCR7、SDC2和TNFRSF10DmRNA)和蛋白(HSP90α、AnnexinA1、14-3-3β和CXCR7)表达差异:采用免疫组化验证蛋白(HSP90α、AnnexinA1和14-3-3β)在86对新疆哈萨克族食管鳞癌和癌旁组织中的表达,分析各蛋白表达水平与浸润深度、分化程度、淋巴结转移、性别、年龄、大体类型、肿瘤位置和大小等临床病理参数的相关性;3)采用RNAi干扰技术下调CE81T-4细胞中HSP90AA1的表达,绿色荧光、qRT-PCR及Western blot检测转染效果,MTT法检测CE81T-4细胞的增殖;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡;划痕愈合实验、Transwell侵袭实验检测细胞迁移、侵袭能力;Western blot检测MET、MMP2、ERK和P-ERK蛋白的表达变化;qRT-PCR检测MET和MMP2mRNA表达差异;复制裸鼠皮下移植瘤模型,观察移植瘤增殖速度和瘤体重量。结果:1)Transwell小室筛选出Eca109-T4高侵袭转移潜能人食管鳞癌细胞亚系,体内外生物学特性比较结果:Eca109-T4、CE81T-4的增殖、迁移及体外成瘤能力均高于Eca109-T0和CE81T-0;Eca109-T4的迁移、浸润能力高于CE81T-4组;对Eca109-T0和Eca109-T4基因芯片检测,共筛选出326个差异基因,其中Eca109-T4组上调123个,与Eca109-T0比较下调表达203个;GO聚类分析显示差异基因主要定位在细胞质、细胞核和细胞液;分子功能涉及蛋白结合,金属离子结合和DNA结合等;参与细胞信号转导、转录、细胞凋亡、细胞增殖、细胞黏附等生物学过程;KEGG聚类分析显示差异基因主要参与肌动蛋白细胞骨架调节、mapk通路和癌症通路等信号转导途径;2)验证结果与基因芯片筛选结果基本一致,qrt-pcr检测:hsp90aa1、ywhab、cxcr7和sdc2mrna在eca109-t4、ce81t-4的表达高于在eca109-t0、ce81t-0的表达(p0.05);tnfrsf10dmrna在ce81t-4组低于在eca109-t4的表达(p0.05);annexina1在eca109-t0、ce81t-0的表达高于在eca109-t4、ce81t-4表达(p0.05);westernblot结果:hsp90α、14-3-3β、cxcr7蛋白在eca109-t0和ce81t-0低于在eca109-t4和ce81t-4的表达(p0.05),annexina1蛋白在eca109-t0、ce81t-0的表达高于在eca109-t4和ce81t-4的表达(p0.05);hsp90aa1mrna和hsp90α蛋白在ce81t-4表达高于在eca109-t4的表达(p0.05);免疫组化结果:hsp90α、14-3-3β在新疆哈萨克族食管鳞癌组织中阳性表达率高于在癌旁组织的表达(87.2%㤘18.6%,80.23%㤘41.86%,p=0.000,0.0002),annexina1在食管鳞癌组织的表达低于在癌旁组织表达(32.6%㤘59.3%,p=0.0002);hsp90α与肿瘤浸润深度、分化程度、淋巴结转移相关(p=0.024、0.021、0.011),与患者性别、年龄、类型、位置和肿瘤大小无关(p0.05);annexina1与分化程度和淋巴结转移相关(p=0.037、0.014),与浸润深度、年龄、性别、类型、肿瘤大小和位置等其他病理参数无关(p0.05);14-3-3β表达与浸润深度和分化程度有关(p=0.008、0.035),与年龄、性别、淋巴结转移、类型、位置和肿瘤大小无关(p0.05);3)hsp90aa1-rnai干扰ce81t-4细胞后可见到绿色荧光,hsp90aa1mrna和hsp90α蛋白在实验组(hsp90aa1-rnai)的表达低于阴性组对照组(nc-rnai)和正常培养组(nc)(p0.05),证实有效下调hsp90aa1表达;mtt检测0h和24h两个时间点各组无差异(p0.05),在48h、72h和96hhsp90aa1-rnai组细胞增殖被抑制(p0.05);hsp90aa1-rnai组细胞周期阻滞于g0/g1期,hsp90aa1下调诱导细胞凋亡,凋亡率在hsp90aa1-rnai、nc-rnai和nc组分别为(27.30±4.33)%、(5.63±1.12)%、(10.20±2.04)%(p0.05);划痕后24h、48h和72h各时间点hsp90aa1-rnai组细胞的迁移距离减小(p0.05);transwell侵袭实验结果:hsp90aa1-rnai组侵袭细胞数目降低(p0.05);westernblot检测hsp90aa1-rnai组的met、mmp2和p-erk蛋白表达降低(p0.05),erk在各组表达无差异(p0.05);qrt-pcr检测met、mmp2mrna在hsp90aa1-rnai组表达降低(p0.05);hsp90aa1-rnai组皮下移植瘤增殖速度慢,重量低(p0.05)。结论:1)建立的不同侵袭转移潜能食管鳞癌细胞株模型,为后续研究提供了模型;侵袭转移差异基因表达谱的建立和生物信息学分析为深入转移相关研究提供了丰富的信息;2)hsp90aa1、anxa1、ywhab、cxcr7和sdc2与食管鳞癌侵袭转移有关;hsp90α、14-3-3β在食管鳞癌高表达,它们与浸润深度呈正相关,与分化程度呈负相关;hsp90α和淋巴结转移呈正相关;annexina1在食管鳞癌中低表达,在分化程度高的,无淋巴结转移的食管鳞癌中Annexin A1表达上调;HSP90α、Annexin A1及14-3-3β的表达可一定程度反映食管鳞癌的分化程度、侵袭深度和有无淋巴结转移,有望成为食管鳞癌早期诊断,预测转移,侵袭和分化程度的分子标志物;2)RNAi技术可有效抑制CE81T-4细胞中靶基因HSP90AA1表达,HSP90AA1下调表达使CE81T-4细胞周期阻滞于G0/G1期,促进凋亡,抑制增殖、侵袭和迁移能力,可能通过下调P-ERK、MET和MMP2机制介导的。
[Abstract]:Objective : To investigate the expression of HSP90AA1 ( HSP90伪 , AnnexinA1 and 14 - 3 - 3尾 ) in esophageal squamous cell carcinoma of Xinjiang , and to investigate the expression of HSP90伪 , AnnexinA1 and 14 - 3 - 3尾in esophageal squamous cell carcinoma of Xinjiang . The expression of HSP90AA1 in CE81T - 4 cells was regulated by using RNAi interference technique . The results showed that the expression of HSP90AA1 in CE81T - 4 cells was lower than that of CE81T - 4 . The results showed that the expression of Eca109 - T4 , CE81T - 4 was higher than that of CE81T - 4 . The expression of annexina1 in eca109 - t0 and ce81t - 0 was higher than that in eca109 - t4 and ce81t - 4 ( p0.05 ) ; the expression of annexina1 in eca109 - t0 and ce81t - 0 was higher than that in eca109 - t4 and ce81t - 4 ( p0.05 ) ; the expression of annexina1 in eca109 - t0 and ce81t - 0 was higher than that in eca109 - t4 and ce81t - 4 ( p0.05 ) ; It may be mediated by downregulating the P - ERK , MET , and MMP2 mechanisms .
【学位授予单位】：新疆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.1
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本文编号：1674632
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