BIX-01294靶向抑制组蛋白甲基转移酶G9a通过线粒体凋亡途径抑制肺腺癌细胞的增殖

发布时间：2018-03-28 04:34

  本文选题：肺腺癌　切入点：组蛋白甲基转移酶G9a　出处：《浙江大学》2017年硕士论文

【摘要】：背景和目的目前,肺癌是我国最常见且死亡率最高的恶性肿瘤之一,并且发病率仍呈上升趋势。根据肺癌的病理特征,有非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)两大类,目前NSCLC占确诊肺癌病例的75%-80%;NSCLC又可细分为鳞癌、腺癌、腺鳞癌及大细胞癌等病理类型,其中肺腺癌约占NSCLC的50%。目前,肺癌已被广泛认为是一种全身性的疾病,虽然手术治疗在早中期肺腺癌治疗方案选择上处于不可撼动的地位,但是多学科的综合治疗越来越受重视。因此,深入研究肺腺癌的发病机理,筛选鉴定病理演进过程中的重要环节和关键分子,研发具有临床治疗价值的新型靶向药物以改善患者的预后具有重要的科学和临床价值。研究证实,表观遗传调控异常与原癌基因的激活、抑癌基因表达的缺失高度相关,且在肿瘤的发生发展中具有重要作用,其中组蛋白甲基化修饰是细胞调控基因表达的重要途径之一,参与多种肿瘤的发生发展。组蛋白甲基化是一个可逆的动态修饰过程,由特异的组蛋白甲基转移酶和组蛋白去甲基酶协调完成。组蛋白甲基转移酶G9a属于SET域家族,催化组蛋白H3K9的单甲基化和二甲基化,其在肝癌、结肠癌、前列腺癌等多种肿瘤中有异常表达现象,可使肿瘤发生恶性进展导致预后不良。本研究拟通过体外实验,以人肺腺癌细胞作为疾病模型,利用小分子靶向抑制剂BIX-01294干扰G9a的甲基转移酶活性,观察肿瘤细胞生长、增殖的变化和凋亡情况,同时检测凋亡信号通路蛋白表达水平的变化,G9a催化产物H3K9me、H3K9me2的表达水平;应用pan Caspases抑制剂Z-VAD-FMK预处理细胞,研究BIX-01294靶向抑制G9a诱导肺腺癌细胞凋亡是否是Caspase途径依赖性的;深入探讨BIX-01294抑制人肺腺癌细胞增殖的作用效应及分子机制。方法培养人肺腺癌细胞A549、H1650和H1975,MTT实验分析BIX-01294作用细胞24h对其生长的影响,BIX-01294作用7d,集落形成实验分析A549、H1650和H1975细胞的增殖能力;BIX-01294作用24h,Annexin V-FITC/PI双染法分析A549和H1975细胞凋亡率的变化;BIX-01294作用24h,Western blot实验检测G9a催化产物H3K9me、H3K9me2和细胞凋亡相关蛋白表达的水平;进一步应用pan Caspase抑制剂Z-VAD-FMK预处理A549细胞2h,抑制内源性Caspase的活性,研究Caspase级联反应在BIX-01294诱导A549细胞凋亡、及凋亡相关蛋白表达中的作用。结果BIX-01294呈剂量依赖关系抑制肺腺癌细胞A549、H1650和H1975的增殖,不同浓度BIX-01294(1、2.5、5和10μM)作用24h,A549细胞的存活率分别为106.3%±7.2%、81.1%±4.8%、52.9%±5.6%和 19.8%±3.6%;H1650 细胞的存活率分别为 91.2%±4.4%、78.2%±5.1%、41.6%±4.8%和 16.8%±3.5%;H1975 细胞的存活率分别为 102.4%±6.3%、73.3%±4.3%、36.4%±2.8%和 12.5%±2.4%。集落形成实验发现,BIX-01294(10μM)作用A549细胞7d,空白对照组的集落形成数为172.7±23.0,BIX-01294组为42.5±8.7,显著抑制A549细胞集落克隆的形成(p0.05);BIX-01294(10μM)作用H1975细胞7d,空白对照组的集落形成数为205.1±42.8,BIX-01294组为35.7±6.5,显著抑制肺腺癌细胞H1975集落克隆的形成(p0.05)。Annexin V-FITC/PI 双染实验结果显示,BIX-01294(10μM)作用24h,A549细胞的凋亡率由7.2%±3.6%上升至47.6%±8.4%,两组间差异有统计学意义(p0.05);H1975细胞的凋亡率由8.9%±5.2%上升至62.8%±8.2%,两组间差异有统计学意义(p0.05)。BIX-01294作用24h,A549和H1975细胞中G9a催化产物H3K9me、H3K9me2的表达均显著下降;线粒体凋亡途径蛋白Bax、Bak和cleaved caspase9表达上调,抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降,凋亡执行蛋白cleaved caspase3和cleaved PARP表达显著上调。pan Caspase抑制剂Z-VAD-FMK预处理A549细胞,显著抑制BIX-01294诱导的细胞凋亡和cleaved caspase3和cleaved PARP蛋白的表达。结论小分子化合物BIX-01294靶向抑制组蛋白甲基转移酶G9a具有抑制肺腺癌细胞增殖的作用效应,其分子机制是上调促凋亡蛋白Bax和Bak的表达,凋亡抑制蛋白Bcl-2表达下降,激活线粒体凋亡途径,进而启动Caspase级联反应,诱导肺腺癌细胞的凋亡。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R734.2
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本文编号：1674798