小柴胡汤调控miR-122逆转肝癌多药耐药的作用机制

发布时间：2018-03-28 17:09

  本文选题：肝癌　切入点：小柴胡汤　出处：《福建中医药大学》2016年博士论文

【摘要】：目的：通过体内外实验研究小柴胡汤对肝癌多药耐药的逆转作用,并探讨其机制及作用靶点。方法：1.体外实验：通过MTT法检测肝癌亲本细胞BEL-7402及耐药细胞株BEL-7402/5-FU的细胞活力,应用SPSS软件计算耐药指数和小柴胡汤的逆转倍数,验证BEL-7402/5-FU耐药细胞对化疗药物的耐药性以及小柴胡汤对化疗药物的逆转耐药作用;MTT法检测小柴胡汤对耐药细胞的活力的影响,倒置相差显微镜观察细胞的形态学变化,集落形成实验检测小柴胡汤对耐药细胞存活能力的影响,流式细胞仪(FCM)检测细胞周期分布研究小柴胡汤对BEL-7402/5-FU耐药细胞增殖的影响；Hoechst33258染色观察小柴胡汤对BEL-7402/5-FU耐药细胞凋亡的影响；Annexin V-PI凋亡检测试剂盒检测细胞早期凋亡研究小柴胡汤对BEL-7402/5-FU细胞凋亡的影响；采用荧光素酶报告基因检测ATP含量；高效液相色谱仪(HPLC)检测小柴胡汤对细胞内5-FU蓄积的影响；流式细胞仪(FCM)检测小柴胡汤对细胞内阿霉素(ADM)和罗丹明(Rho123)浓度的影响。通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western Blot法检测小柴胡汤对Bax、Bcl-2、CyclinGl及ABCB1(p-gp)、ABCC1(MRP1)、ABCG2(BCRP)在mRNA和蛋白水平表达的影响。2.体内实验：分别将BEL-7402细胞及其耐药株BEL-7402/5-FU细胞接种于裸鼠腋下建立裸鼠的皮下移植瘤模型,用5-FU (20 mg/kg)连续干预21天,检测两种移植瘤裸鼠的体重、瘤体变化和瘤重等观察耐药细胞建立的皮下移植瘤组织的耐药性；建立裸鼠的耐药移植瘤模型,按照体重随机分为对照组、5-FU组(20mg/kg)、小柴胡汤组(XCHT, 14.2 g/kg)和联合给药(5-FU+XCHT)组,分别给药21天,检测体重变化评估药物的毒副作用,观察和测量移植瘤裸鼠的肿瘤体积和重量评估小柴胡汤对裸鼠移植瘤生长的影响；通过TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling (TUNEL)法检测小柴胡汤对耐药移植瘤组织细胞凋亡的影响,应用免疫组织化学法(IHC)研究小柴胡汤对耐药移植瘤组织Ki-67表达的影响；通过RT-PCR和Western-Blot法检测小柴胡汤对Bax、Bcl-2、yclinGl及ABCB1(p-gp)、ABCC1(MRP1)、 ABCG2(BCRP) mRNA和蛋白表达的影响。3.靶点验证：绘制BEL-7402和BEL-7402/5-FU细胞的生长曲线,分别计算其倍增时间：qPCR检测BEL-7402和BEL-7402/5-FU细胞及其移植瘤组织miR-122的表达；BEL-7402和BEL-7402/5-FU细胞分别转染inhibitor-miR-122(ASO-miR-122)或mimics-miR-122,检测miR-122表达及对化疗药物耐药性；观察BEL-7402/5-FU细胞转染mimics-miR-122后的细胞形态及细胞数改变,DAPI染色和Annexin V-PI凋亡检测试剂盒检测miR-122对细胞凋亡影响；克隆形成实验和细胞周期检测miR-122对细胞增殖的影响；流式细胞仪检测细胞内Rho123和ADM的蓄积情况,观察miR-122对药物外排功能的影响。采用qPCR和Western Blot法检测miR-122对靶基因Bax、CDK4、CyclinGl和ABCB1表达的影响。结果：1、细胞实验：(1)BEL-7402/5-FU细胞经5-FU、 ADM和DDP干预48 h后的IC50均显著大于BEL-7402细胞,耐药指数(RI)分别为6501.99,31.73和13.82；(2)0.5 mg/mL或1.0 mg/mL小柴胡汤分别与5-FU和ADM联合干预BEL-7402和BEL-7402/5-FU,与单独使用5-FU和ADM相比较,两株细胞的ICs0均显著降低,0.5 mg/mL或1.0 mg/mL小柴胡汤对5-FU和ADM的逆转倍数分别是1.66,3.44和1.50,5.58,相对逆转率分别为39.88%,71.34%和34.11%,84.51%;(3)小柴胡汤抑制BEL-7402/5-FU细胞增殖：MTT检测细胞活力发现小柴胡汤显著降低BEL-7402/5-FU细胞活力,呈剂量和时间依赖性；倒置显微镜观察发现不同浓度小柴胡汤均可以不同程度抑制细胞生长,且随着浓度增高,其抑制程度也越强；集落形成实验发现不同浓度小柴胡汤均能够不同程度减少集落形成数量,影响细胞的生存能力；流式细胞仪检测细胞周期发现小柴胡汤能够改变细胞周期分布,使BEL-7402/5-FU细胞阻滞于G2/M期;小柴胡汤下调CyclinGl的表达。(4)小柴胡汤诱导BEL-7402/5-FU细胞凋亡：荧光显微镜观察发现小柴胡汤能够诱导BEL-7402/5-FU细胞凋亡,不同浓度小柴胡汤浓度干预可使细胞密度减小,核高染(亮染)的细胞数增加；Annexin V-PI凋亡检测结果显示小柴胡汤诱导BEL-7402/5-FU细胞早期凋亡,且呈剂量依赖；小柴胡汤上调Bax表达,下调Bc1-2表达。(5)小柴胡汤抑制药物泵的外排作用：小柴胡汤能够显著增加5-FU和ADM在BEL-7402/5-FU细胞内的蓄积;小柴胡汤增加BEL-7402/5-FU细胞内Rho123的蓄积；小柴胡汤显著降低BEL-7402/5-FU细胞内ATP的含量；小柴胡汤能够显著下调多药耐药相关基因ABCB1、 ABCC1及ABCG2的mRNA和蛋白表达。2、动物实验：(1)BEL-7402和BEL-7402/5-FU细胞移植瘤的体积和重量检测结果提示BEL-7402/5-FU细胞移植瘤较BEL-7402细胞移植瘤具有更明显的耐药性,而小柴胡汤能够显著抑制移植瘤生长,表明小柴胡汤可以降低BEL-7402/5-FU细胞移植瘤的化疗耐药；(2)TUNEL检测细胞凋亡发现,与对照组比较,小柴胡汤和联合给药均可以显著增加TUNEL的阳性细胞表达率,促进耐药移植瘤组织的细胞凋亡,5-FU对TUNEL的阳性细胞表达率没有明显影响；(3)IHC检测Ki-67表达结果发现小柴胡汤能够显著增加Ki-67的阳性表达率,抑制耐药移植瘤细胞增殖,而5-FU对耐药移植瘤组织的细胞增殖未见明显变化：(4)RT-PCR和Western-blot结果发现小柴胡汤能够显著下调Bcl-2、 cyclinGl和转运蛋白ABCB1、ABCC1、ABCG2的表达,上调Bax的表达；而5-FU对上述相关基因表达未见显著影响。3、靶点验证：与BEL-7402细胞比较,BEL-7402/5-FU细胞倍增时间延长17.04 h,且具有更高的耐药性；BEL-7402/5-FU细胞或移植瘤组织miR-122表达降低,与BEL-7402细胞或移植瘤比较,分别降低0.57倍和0.61倍,小柴胡汤增加耐药细胞或移植瘤中miR-122的表达,分别升高2.36倍和2.82倍；BEL-7402和BEL-7402/5-FU细胞分别转染inhibitors-miR-122或mimics-miR-122后,miR-122表达分别降低0.71倍或升高2056.98倍；BEL-7402转染inhibitors-miR-122后,对5-FU耐药性没有明显改变,BEL-7402/5-FU细胞转染mimics-miR-122,在0-1200 μM范围内,增加BEL-7402/5-FU对5-FU的敏感性；BEL-7402/5-FU细胞转染mimics-miR-122能够抑制BEL-7402/5-FU细胞生长,增加其对5-FU的敏感性；miR-122能够促进BEL-7402/5-FU细胞细胞凋亡；miR-122可以抑制BEL-7402/5-FU细胞增殖；miR-122增加ADM和Rho123在BEL-7402/5-FU细胞内的蓄积；miR-122调节靶基因Bax、CDK4、CyclinGl和ABCB1的mRNA和蛋白表达。结论：1.体内外实验结果表明小柴胡汤能够逆转肝癌多药耐药；2.小柴胡汤逆转肝癌多药耐药机制可能有以下几个方面：(1)小柴胡汤显著抑制耐药细胞BEL-7402/5-FU细胞增殖；(2)小柴胡汤促进耐药细胞BEL-7402/5-FU细胞凋亡；(3)小柴胡汤抑制耐药细胞BEL-7402/5-FU细胞药物外排功能；(4)小柴胡汤调控miR-122及其靶基因促进BEL-7402/5-FU凋亡,抑制细胞增殖及药物的外排功能。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：福建中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7

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本文编号：1677257