Let-7f在胶质瘤中的表达与临床的相关性及调控靶基因RAB40C对细胞增殖的影响

发布时间：2018-04-01 10:25

本文选题：胶质瘤　切入点：Let-7f　出处：《山东大学》2016年博士论文

【摘要】：研究背景人脑胶质瘤是颅内最常见的原发性中枢神经系统肿瘤,可占全部颅内肿瘤的60%左右。肿瘤呈浸润性生长,手术难以彻底切除,治疗效果差,死亡率高。现阶段治疗除手术切除外,又结合了放疗、化疗等综合治疗措施,胶质瘤的致死率略微下降,但是由于其具有高度的侵袭及增殖能力,整体的预后仍不理想,5年死亡率超过95%。胶质瘤的治疗一直是神经外科医师治疗神经肿瘤疾病所面临的难题。作为一种多基因异常疾病,胶质瘤的发病原因为抑癌基因失活、原癌基因激活所引发的诸多基因异常问题,以及这些问题的动态发展。所以,对于胶质瘤发生机制的研究及诊断、治疗来说,通过免疫组织化学、分子生物学等技术手段,对相关蛋白水平、基因的变化差异进行分析,具有不容忽视的意义。miRNA是一类进化上非常保守、长度约18～25个核苷酸大小的非编码调控小分子RNA。通过特异性结合靶基因3'端非转录区域,能够抑制靶nRNA的翻译,或借助降解靶mRNA的方式,完成转录、调控基因的任务。据统计,miRNA所调控的基因,在人类基因组中的占比约为三成,相关研究成果表明,该分子参与调节多种癌症的发生与发展,发挥”癌基因”或”抑癌基因”的功能。异常表达的miRNAS普遍存在于胶质瘤细胞中,对肿瘤发生、演进等带来不同程度的影响。miRNA的种类较多,Let-7家族是目前研究最广泛的miRNA之一。Let-7家族共包括13个成员,Let-7f是家族成员之一,位于9q22.3。目前研究发现,Let-7f在不同的肿瘤中表达是不同的。在大多数肿瘤如卵巢癌、肺癌、胃癌中表达下调,而在乳腺癌和肝癌中的表达上调,Let-7f的异常表达可能在恶性肿瘤的发生发展中起到重要作用。目前,在胶质瘤方面的研究尚处于起步阶段,虽已有研究报道Let-7f对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响,但Let-7f有许多靶基因,它们与Let-7f共同组成一个复杂的调控网络,不同靶基因以不同的信号通路参与Let-7f对肿瘤细胞生长的调控,所以具体机制仍需进一步研究。miRNA不但存在于脑组织中,亦存在于血清及脑脊液样本中。在癌症的诊断过程中,作为一种可操作性较强的潜在标志物,miRNA在体液中具有较为稳定的表达,同时还表现出低损伤性、高灵敏度、检测难度小等特点。已有文献报道,应用血液中miRNA的含量的变化早期诊断神经胶质瘤,如miRNA-205, miRNA-128和miRNA-210等。这些生物标志物的敏感度和特异度各不相同,仍存在诸多不足,迄今为止尚没有一种能得到国内外学者公认的可以通过血清稳定检测到的miRNA临床应用于胶质瘤的早期诊断和预后评估。对于Let-7f在实体肿瘤中表达的临床意义及在预后判断方面的价值目前研究不多,为了观察Let-7f在胶质瘤患者中的表达情况并进一步探讨对于早期诊断和预后评估可能发挥的作用,我们检测了胶质瘤患者肿瘤组织与正常脑组织、血清与健康对照者血清Let-7f表达水平差异,并结合患者临床数据、组织病理学特征、术后生存时间等对其在胶质瘤患者预后评估和早期诊断的价值进行了分析。为了探讨Let-7f调控胶质瘤细胞增殖的作用机制,我们检测了Let-7f在胶质瘤细胞系与正常星形细胞系中的表达差异,以及Let-7f对体外胶质瘤细胞生长增殖能力的影响。找出并验证RAB40C为Let-7f在胶质瘤细胞中的目标靶基因,并对其在细胞增殖方面的调节作用机制进行初步探究,以期对Let-7f表达水平的临床意义及胶质瘤的分子靶向治疗提供理论基础支持。本课题实验分为以下两部分：第一部分：Let-7f在胶质瘤中的表达及其与临床的相关性研究目的：检测Let-7f在胶质瘤患者肿瘤组织及血清中的表达水平；探讨Let-7f表达水平与患者临床特征之间的关系及对预后判断及早期诊断的意义。方法：1、通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测108例胶质瘤患者肿瘤组织及瘤旁非瘤性正常脑组织样本中Let-7f的表达情况；检测108例胶质瘤患者及40例健康对照者血清中Let-7f的表达情况。2、分析胶质瘤患者肿瘤组织中Let-7f表达水平与患者性别、年龄、肿瘤大小、部位、病理级别及术前KPS评分等临床特点的相关性。3、以Kaplan-Meier生存分析方法研究获得完整随访资料的101例胶质瘤患者中肿瘤组织Let-7f表达水平与患者术后生存时间的相关性。4、以单因素及多因素Cox比例风险回归模型分析胶质瘤患者的性别、年龄、肿瘤大小、部位、病理级别、KPS评分、Le-7f表达水平,寻找影响胶质瘤患者预后的独立危险因素。5、分析不同级别和组别的胶质瘤患者血清Le-7f表达水平的差异。通过ROC曲线及ROC曲线下面积(AUC)来评估血清Let-7f表达水平对不同病理级别胶质瘤的早期诊断价值。结果：1、Let-7f在胶质瘤组织及血液中均呈低表达。108例胶质瘤患者肿瘤组织样本中Le-7f的表达水平明显低于正常脑组织(0.45±0.203 VS 1.09±0.211),两者间有显著统计学差异(P=0.000);胶质瘤患者血清中Let-7f表达水平较40例健康对照者血清有明显降低(0.39±0.201 VS0.88±0.260 P0.001)。Le-7f在胶质瘤患者肿瘤组织及其对应的血清样本中的表达水平具有相关性,相关系数R2=0.853(P=0.01)。2、胶质瘤组织中Let-7f的表达与肿瘤大小、WHO分级显著相关。胶质瘤组织中Let-7f的表达水平在不同肿瘤大小和不同病理级别患者中有显著差异,而与其它因素无明显相关性。以Le-7f的平均表达水平(0.51)为界,所有患者分为高、低水平表达两组。70.6%的WHO分级ⅢI～Ⅳ级胶质瘤患者进入低水平表达组；而Ⅰ-Ⅱ级患者中,Let-7f的表达水平低于均值的仅有35.1%,差异显著(χ2=13.588 P=0.001)。不同WHO分级的两组患者Let-7f平均表达水平者有显著差异(0.33±0.191 VS 0.79±0.20 P0.001)。肿瘤直径在3cm以上的胶质瘤患者Le-7f低表达比例及Let-7f平均表达水平与肿瘤直径在3cm以下患者有显著差异(χ2=8.306 P=0.004；0.38±0.193 VS 0.69±0.198 P0.01)。3、胶质瘤组织中Let-7f的表达水平越低,患者术后生存时间越短。Kaplan-Meier生存分析方法显示：获得完整随访资料的101例胶质瘤患者中肿瘤组织Let-7f呈低表达水平的患者术后生存时间明显短于高表达组患者(24.1 month VS 34.5 month), Log rank检验显示两组有显著性差异(P=0.000)。47例WHO分级m～Ⅳ级患者中,Le-7f低表达组的患者术后中位生存时间与高表达组患者差异显著(13.2month VS 24.5 month P0.001)。而在54例Ⅰ～Ⅱ级患者中,Let-7f低表达组患者的术后中位生存时间与高表达组患者并无显著性差异(37.3month VS 41.7 month P0.05)。4、Let-7f是影响胶质瘤患者预后的独立危险因素。单因素分析检验结果显示,KPS评分80分、WHO分级增高和肿瘤组织中Let-7f低表达均是影响胶质瘤患者预后的因素。运用单变量和多变量Cox比例风险回归模型分析结果显示,KPS评分、WHO分级和肿瘤组织中Let-7f表达水平均是影响胶质瘤患者预后的独立因素指标。KPS评分越低、WHO分级越高和以及肿瘤组织中Let-7f表达水平越低,则患者的预后越差。显示Let-7f的表达与预后显著相关,是影响胶质瘤患者预后的独立危险因素(HR=1.971,95%CI=1.381-2.813,P=0.000)。5、.胶质瘤患者血清Let-7f表达水平对恶性胶质瘤早期诊断具有一定意义。胶质瘤患者的血清Let-7f表达水平与WHO分级密切相关(P0.001)。所有级别胶质瘤的AUC为0.719(95% CI,0.653-0.828)。血清Let-7f的临界值为1.50,相应的敏感度和特异度分别为53.6%和82.1%。高级别胶质瘤AUC为0.795(95% CI,0.688-0.901),提示Le-7f对恶性胶质瘤早期诊断具有一定意义。结论：胶质瘤患者肿瘤组织及血液中Let-7f均呈现低表达。Let-7f可作为一种新的肿瘤标志物,对判定胶质瘤恶性程度和预后分析带来帮助,并对恶性胶质瘤具有一定的早期诊断价值。第二部分：Let-7f通过靶基因RAB40C抑制胶质瘤细胞增殖的机制研究目的：检测Let-7f在人胶质瘤细胞系和正常星形细胞中的表达情况；寻找并验证Let-7f在胶质瘤细胞中的下游靶基因,探讨Let-7f通过靶基因调控胶质瘤增殖的作用机制。方法：1、应用RT-qPCR方法检测Let-7f在胶质瘤细胞系U251、SHG-44、A172、U138、T98G和正常星型细胞中的的表达水平。2、通过Lipofectamine2000瞬时转染技术将Let-7fmimics、Let-7finhibitor分别转染入A172、T98G。qRT-PCR检测转染效率。CCK-8法进行细胞增殖实验,以细胞转染作为时间节点,检测时间分别为细胞生长的第24、48、72、96小时。流式细胞仪检测细胞生长周期变化。3、检索miRBase、Targetscan、microRNAs等数据库,寻找Le-7f的目标靶基因。运用RT-PCR和Western blot技术分别对转染细胞进行检测,研究抑制和过表达Let-7f对靶基因转录和蛋白表达的影响。应用双荧光素酶报告系统验证寻找到的靶基因是否为Let-7f的下游目标靶基因。4、分别干扰和过表达Le-7f及靶基因RAB40C,并分为4组进行比较：A组：control、siRNA-Let-7f, si-RAB40C、siRNA-Let-7f+si-RAB40C; B组:control, Let-7finimics、pEGFP-C1-RAB40C、Let-7fmimics+pEGFP-C1-RAB40C; C组: control、siRNA-Let-7f、pEGFP-C1-RAB40C、siRNA-Let-7f+ pEGFP-C1-RAB40C; D组:control、Let-7fmimics、si-RAB40C、Let-7finimics+si-RAB40C。采用 CCK-8法对转染细胞进行增殖能力检测,通过比较分析Le-7f及其靶基因RAB40C在胶质瘤细胞增殖活动中的分子作用机制。结果：1、Let-7f在胶质瘤细胞系中表达下调Let-7f在胶质瘤细胞系U251、SHG-44、A172、U138、T98G中的表达水平明显低于正常星型细胞中的的表达(P0.01),选择表达最低的A172、T98G进行进一步的实验研究。2、Let-7f抑制胶质瘤细胞增殖Lipofectamine2000瞬时转染法成功将Let-7fmimics、Let-7finhibitor转染入胶质瘤细胞A172、T98G、qRT-PCR检测转染效率满意。转染Let-7fmimics后细胞增殖能力比转染Let-7finimicsNC或未转染组明显降低,流式细胞仪检测显示GO期细胞比例增加,S期细胞比例减少；而转染Let-7finhibitor后细胞的增殖能力显著升高,流式细胞仪检测显示GO期细胞比例降低,S期细胞比例升高。差异具有统计学意义(P0.01)。3、Le-7f功能靶基因为RAB40C搜索数据库结果发现RAB40 C的3'UTR与Let-7f存在潜在的结合位点。胶质瘤细胞系转染Let-7finimics、Let-7finhibitor结果显示：相比于未转染组、Let-7finimicsNC组,Let-7finimics组的RAB40C表达水平降幅明显(P0.001)。双荧光素酶报告基因活性检测结果表明,共转染野生型RAB40C表达载体与Let-7finimics后,荧光素酶相对活性明显下降(P0.01)；而共转染野生型AB40C表达载体与Let-7finhibitor后,荧光素酶相对活性升高(P0.01)。在突变型RAB40C表达载体与Let-7finimics 和 Let-7finhibitor共转染体系中均未检测到荧光素酶相对活性有明显改变。4、RAB40C参与Let-7f对胶质瘤细胞增殖的调控结果显示siRNA-Let-7f, pEGFP-C1-RAB40C细胞增殖能力增强(P0.01)；Let-7finimics、si-RAB40C细胞增殖能力降低(P0.01)siRNA-Let-7f+si-RAB40C、let-7mimics + pEGFP-C1-RAB40C细胞增殖变化不明显;siRNA-Let-7f+ pEGFP-C1-RAB40C细胞增殖能力显著增强(P0.001)；Let-7finimics+si-RAB40C细胞增殖能力显著降低(P0.001)。表明过表达Let-7f抑制的胶质瘤细胞增殖可被过表达的RAB40C拮抗。证实Let-7f是通过特异性结合RAB40C对其进行负性调节,减少RAB40C基因的转录和蛋白表达,从而起到抑制胶质瘤细胞增殖的作用。结论：RAB40C是Let-7f的功能靶基因,Let-7f通过对RAB40C的负性调节抑制胶质瘤细胞的增殖,对Let-7f及其靶基因RAB40C的表达进行调控可能为胶质瘤的治疗提供一种新的有效途径。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.41

【参考文献】