孕激素受体抑制剂RU-486对PR-M阳性原代子宫平滑肌瘤细胞增殖和凋亡的影响

发布时间：2018-04-02 15:35

本文选题：孕激素受体M　切入点：原代培养　出处：《郑州大学》2017年硕士论文

【摘要】：孕激素受体M(mitochondrial progesterone receptor,PR-M)是一种新型的孕激素受体,在2002年由Saner,KJ等发现,其定位于核外线粒体,与传统孕激素受体PR-A、PR-B相比结构上缺乏N端的A/B结构区和DNA结合区,仅有铰链区和配体结合区,是截短的新型孕激素受体。PR-M独特的线粒体定位功能可能是由于其氨基末端的16个氨基酸所组成序列中包含的线粒体定位序列(mitochondrial localization signal,MLS)的存在。目前认为,PR-M可能通过调节线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)发挥其独特的作用。研究发现孕激素可以通过剂量依赖性增加原代培养的子宫平滑肌细胞和永生化子宫平滑肌细胞的线粒体膜电位的形式发挥作用,并且这种反应的发生可以被孕激素受体拮抗剂抑制。从而说明孕激素可能通过PR-M的非基因组作用增加细胞的能量代谢,而细胞内能量的增加使得细胞发生异常增殖。孕激素可以促使PR-M使线粒体膜电位增加,抑制乳腺癌细胞、原代和永生化子宫平滑肌细胞的凋亡。子宫肌瘤(leiomyoma)是最常见的女性盆腔良性肿瘤,影响30%-50%的育龄期女性,且发病率呈逐年上升趋势,是临床子宫切除术的主要原因,临床表现有月经异常,不孕,和疼痛等,严重影响女性患者的生存质量。然而至今其病因病机仍未明确,探讨其发病机制及有效的治疗方案一直是国内外妇科方面专家研究的热点。文献报道基础和临床研究均已表明孕激素在子宫平滑肌瘤的发生中发挥着重要的作用。我们先前的研究发现肌瘤组织中孕激素受体PR-B、PR-A和PR-M的表达均明显高于它们在子宫肌瘤旁正常子宫平滑肌组织中的表达水平,提示PR-M在肌瘤生长过程中可能发挥促进作用,孕激素在肌瘤组织中可能通过基因组和非基因组途径发挥双重效应。米非司酮(Mifepristone,RU 486)是一种结构类似类固醇激素的复合物。这种复合物对于孕激素受体和糖皮质激素受体具有极强的亲和力,并在较小程度上与雄激素受体结合。它通过不同的信号转导通路,发挥基因组和非基因组作用。米非司酮最初作为妊娠早期的流产药物应用,近年来也应用于治疗子宫肌瘤等疾病,米非司酮用于治疗子宫肌瘤具有效果好,副作用少,复发率低等优势,但作用机制目前尚不明确。目的在课题组之前的研究基础上收集肌瘤标本提取原代子宫肌瘤细胞作为研究材料,Western blot检测孕激素受体的表达并筛选出PR-M阳性细胞株,应用不同浓度梯度的孕激素受体抑制剂RU486干预后,分别应用CCK-8法和流式细胞仪检测PR-M阳性组和PR-M阴性组子宫肌瘤细胞增殖和凋亡的变化情况,进一步研究PR-M在子宫肌瘤发生发展中的作用,探讨其可能的作用机制,从而深化对PR-M功能作用的理解,给妇产科孕激素相关疾病的诊断治疗提供新的思路和研究方向。材料和方法1研究对象随机选取2015年9月到2016年6月期间在我院(即郑州大学第三附属医院)因单纯子宫肌瘤行腹腔镜下全子宫切除术或腹式肌瘤挖除术的患者11例,年龄24~48岁,平均(42±4.49)岁。所有患者均不伴随其他性激素相关合并症,且手术治疗前至少半年内无类固醇激素应用史。收集的标本均同时经过腹腔镜或开腹手术诊断、术后常规病理检查证实。所有标本的收集均经过患者的知情同意并签署知情同意书,并经本院伦理委员会审核通过。术中在无菌操作下取大小1-3cm3的肌瘤组织块数块,置于冰盒内保存且含双抗(青链霉素混合液)的DMEM-F12(FD)培养液中,尽快运回实验室进行下一步处理。2试验方法(1)分离子宫肌瘤组织,提取、培养原代子宫平滑肌瘤细胞,并经倒置相差显微镜观察细胞形态,免疫细胞化学法(α-SMA单克隆抗体)鉴定确认为子宫平滑肌瘤细胞;(2)应用免疫印迹法(Western Blotting)检测孕激素受体PR-M、PR-A和PR-B的表达并筛选出PR-M阳性细胞株(即仅表达PR-M,不表达PR-A/B的细胞株)作为研究组,PR-M阴性细胞株(即不表达PR-M,仅表达PR-A/B的细胞株)作为对照组,T-47D乳腺癌细胞株(购自American Type Culture Collection)作为筛选细胞的阳性对照(T47D是经文献证实的同时表达PR-A/B和PR-M的细胞株,因现阶段缺乏针对PR-M的特异性抗体,故选择阳性细胞株用以确认筛选结果)(3)不同浓度RU-486(空白对照,1×10~(-6)umol/ml,1×10~(-5)umol/ml,1×10~(-4)umol/ml)干预两组细胞后,利用CCK-8法检测细胞增殖情况并计算细胞增殖抑制率(加入CCK-8试剂后对各组细胞在波长450nm处的吸光度(A)值进行检测,每组重复三次,设置四个复孔。增殖抑制率的计算公式为对照组和实验组差值与对照组和空白对照组差值的比值。(4)不同浓度RU-486(空白对照,1×10~(-6)mol/L,1×10~(-5)mol/L,1×10~(-4)mol/L)干预两组细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡情况并计算细胞凋亡率。结果1.培养子宫肌瘤细胞11例成功10例,其中1例因细胞量偏少,弃之;成功率91%,与文献报道接近。子宫肌瘤细胞的鉴定:大部分细胞于接种后24h内贴壁并逐渐伸展呈基本规则的长梭形并缓慢生长,3天左右细胞生长速度加快,一周左右进入对数期,且密集处多呈旋涡状,镜下见典型的“峰-谷”样现象,应用免疫细胞化学法鉴定为子宫肌瘤细胞(见图1)。2.Western blot检测孕激素受体PR-A/B,PR-M在子宫肌瘤细胞中的表达后成功筛选出表达PR-M而不表达PR-A/B的标本作为研究组,且筛选表达PR-A/B不表达PR-M的标本作为阴性对照组。3.RU-486干预后两组肌瘤细胞增殖的变化:倒置显微镜下观察可以看到,RU-486作用48h后细胞开始变形,且随着RU-486浓度的不断增加,两组细胞的增殖抑制率不断增加,PR-M阳性组与空白对照组相比差异具有统计学意义(F=8.27,P均0.05);PR-M阴性组与空白对照组相比差异有统计学意义(F=9.14,P均0.05)。增殖抑制率增加呈现出剂量依赖性(P0.05)。PR-M阳性组的增殖抑制率小于PR-M阴性组,相同浓度作用组间两两比较,差异具有统计学意义(P均0.05)。4.RU-486干预后两组肌瘤细胞凋亡率的变化:PR-M阳性组与空白对照组相比差异具有统计学意义(F=7.44,P均0.05);PR-M阴性组与空白对照组相比差异具有统计学意义(F=8.32,P均0.05)。随着药物浓度的不断增加,细胞凋亡率均逐渐增加(P0.05)。相同浓度作用组间两两比较差异有统计学意义(P均0.05)。结论1.PR-M在子宫肌瘤的发生发展中可能通过抑制子宫肌瘤细胞凋亡,促进肌瘤细胞增殖发挥重要作用。2.PR-M的作用可能被孕激素受体抑制剂所抑制。
[Abstract]:PR - M is one of the most common female pelvic benign tumors , which affects the survival quality of female patients . The mechanism of PR - M positive control ( PR - M , PR - A / B only ) was examined by Western Blotting . The expression of PR - A / B , PR - M , PR - M , PR - M , PR - M , PR - M , PR - M , PR - M , PR - M , PR - M , PR - M , PR - M , PR - M and PR - M were observed . The proliferation inhibition rate of PR - M positive group was less than that of PR - M negative group , and the difference was statistically significant ( F = 7.44 , P < 0.05 ) . The difference of PR - M negative group and blank control group was significant ( F = 8.32 , P < 0.05 ) . Conclusion 1 . PR - M may play an important role in the development of uterine fibroids . Conclusion 1 . PR - M may play an important role in the development of uterine fibroids .

【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.33

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