肝细胞肝癌差异表达长链非编码RNA的筛选及其功能研究

发布时间：2018-04-02 16:07

本文选题：肝细胞肝癌　切入点：LncRNA　出处：《浙江大学》2017年博士论文

【摘要】：肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)已成为我国最常见的恶性肿瘤之一,其死亡率位居肿瘤相关死亡的前列。目前手术切除、化疗、放疗,肝移植是治疗肝细胞肝癌的主要手段,由于其进展速度快,恶性程度高,个体差异大,患者术后复发率及转移率仍较高,导致治疗后的总体生存率没有明显上升。然而,我国是乙肝大国且人口基数大,而肝细胞肝癌的发生与乙肝密切相关,因此肝细胞肝癌为我国国民经济和人民健康带来严重负担和威胁。所以,寻找新的肿瘤标记物,探索肝癌发生发展的确切发病机制,开发新的特异性的分子靶向药物是突破肝癌治疗瓶颈的重中之重。长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)是一类长度超过200nt的RNA分子,其没有编码蛋白质的能力,最初其被认为不能发挥生物学功能,只是转录过程中产生的多余产物。然而,近年来的研究表明,lncRNA参与周期,凋亡,增殖,分化等各种细胞生命活动,且与肿瘤的发生发展密切相关。LncRNA在肝细胞肝癌发生发展中的调节作用同样也受到广大学者青睐,比如目前研究较多的有H19,HOTAIR,MEG3等,因此新型LncRNA的发现,作用功能机制的探索为肝细胞肝癌的早期诊断和治疗提供了新的思路和方向。第一部分肝细胞肝癌差异表达长链非编码RNA的筛选目的:挖掘肝细胞肝癌与癌旁组织中差异表达的长链非编码RNA。方法:收集3对经病理证实的肝细胞肝癌及癌旁组织,委托上海伯豪生物技术有限公司进行生物样本的RNA的抽提与质检,芯片实验,数据分析。结果:以差异倍数"g2倍,T检验P值0.05作为筛选条件,肝细胞肝癌中差异表达LncRNA共2320个,其中高表达1048个,低表达1272个。第二部分长链非编码RNAZNF674-AS1在肝细胞肝癌的表达及其临床意义目的:研究ZNF674-AS1在肝细胞肝癌中表达及其临床意义方法:收集肝癌与癌旁组织,通过RT-PCR检测ZNF674-AS1在肝癌组织及肝癌细胞系的表达量;将ZNF674-AS1的表达量与肝癌病人的临床资料做相关性分析及预后生存分析。结果:相对癌旁组织,ZNF674-AS1在137例肝癌组织中低表达99例,且相对与正常肝癌细胞系QSG-7701相比,在肝癌细胞系HCCLM3,SK-Hep1,HuH7,Hep3B及MHCC97H中ZNF674-AS1低表达;ZNF674-AS1表达量的高低与转移(P=0.041),临床分期(P=0.039)和病理学分期(P=0.045)密切相关,且低表达的肝癌病人预后生存差。结论:预示ZNF674-AS1是潜在的抑癌基因,可能在肝癌发生发展中起发挥作用,是一种新的潜在的肝细胞肝癌标记物。第三部分长链非编码RNANCRUPAR的表达下调与肝细胞肝癌的临床特征相关目的:探究长链非编码RNANCRUPAR在肝细胞肝癌中的临床意义方法:收集肝癌及癌旁组织,通过RT-PCR检测NCRUPAR在肝癌组织及肝癌细胞系的表达量;将NCRUPAR的表达量与肝癌病人的临床资料做相关性分析及预后生存分析。结果:NCRUPAR 在肝癌细胞系 HCCLM3,HUH7,MHCC97H,SK-Hep1 and Hep3B中低表达,同时在肝癌组织中也低表达(101/137),且其低表达与门静脉血栓(P=0.046),远处转移(P=0.046),病理学分期相关(P=0.006)。NCRUPAR低表达的肝癌患者预后生存差。结论提示肝癌的发生发展可能与长链非编码RNANCRUPAR的低表达有关,是潜在的肝癌分子标记物。第四部分长链非编码RNA HNF1A-AS1在肝细胞肝癌增殖和转移中的功能机制研究目的:探究长链非编码RNAHNF1A-AS1在肝细胞肝癌增殖和转移中的功能机制方法:通过RT-PCR验证HNF1A-AS1在肝癌临床样本及细胞系的表达,并分析其表达与临床病理特征及预后生存的关系;在HUH7及SMMC7721两种肝癌细胞系中运用小干扰RNA敲低HNF1A-AS1的表达,通过流式细胞技术、EDU、Transwell试验及集落克隆形成实验检测敲低细胞HNF1A-AS1的表达后对凋亡、周期、增殖、克隆形成及迁移侵袭的影响;在动物水平上探究HNF1A-AS1对瘤体生长的影响;最后通过免疫印迹及生物信息学探索HNF1A-AS1在肝细胞肝癌发展中背后的作用机制。结果:通过检测138对肝癌与癌旁组织中HNF1A-AS1的表达发现91对表达上调,47对表达下调,且表达量的高低与乙肝(P=0.036)、肝硬化(P=0.009)、转移CP=0.01)、临床分期(P=0.002)密切相关,生存分析曲线显示高表达HNF1A-AS1的患者预后生存差。且肝癌细胞系HepG2、HCCLM3、SK-Hep1、HUH7、Hep3B、SMMC7721的表达量均高于正常肝细胞系QSG-7701。在细胞功能学实验发现在肝癌细胞系HUH7和SMMC7721中敲低HNF1A-AS1后,肝癌细胞出现凋亡增多,增殖减弱,周期阻滞,集落克隆形成减少。裸鼠瘤体实验发现敲减HNF1A-AS1后瘤体的生长速度和大小均小于对照组。在SMMC7721上敲低HNF1A-AS1后,迁移侵袭能力减弱,同时PIGR蛋白的表达减少,E-cadherin表达增多,Vimentin表达减少;反之过表达HNF1A-AS1后,迁移侵袭能力增强,PIGR蛋白表达升高,E-cadherin表达减少,Vimentin表达增多。且在SMMC7721上敲低和过表达PIGR后,出现和HNF1A-AS1相同的结果。然而在敲低HNF1A-AS1的基础上,过表达PIGR后,肝癌细胞的迁移侵袭能力又变强,同时E-cadherin和Vimentin出现相应变化;反之在过表达HNF1A-AS1的基础上,敲低PIGR后,肝癌细胞的迁移侵袭能力又变弱,同时E-cadherin和Vimentin出现相应变化。结论HNF1A-AS1具有促进肝癌发生发展的作用并通过调控PIGR蛋白的表达参与上皮间质转化促进肝癌转移侵袭
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.7

【参考文献】