Aurora-A诱导BRCA2磷酸化及其与癌症的关系研究

发布时间：2018-04-02 17:53

  本文选题：BRCA2　切入点：Aurora-A激酶　出处：《上海师范大学》2017年硕士论文

【摘要】：研究背景:乳腺癌在女性中最为常见,且恶性程度极高,易发生转移和放化疗抵抗。因此,我们迫切的需要发现并验证出新型的靶向分子标志物,以更深层的研究乳腺癌的作用机制,以便更好的诊断和治疗乳腺癌。乳腺癌易感基因-2(breast cancer type 2 susceptibility protein,BRCA2)是一种抑癌基因。可通过修复DNA损伤、参与有丝分裂和胞质分裂来发挥抑制肿瘤的功能,但由于BRCA2基因序列太长、蛋白结构相当复杂等原因,导致BRCA2在乳腺癌中的具体作用机理还未有广泛研究。乳腺癌激活激酶(Breast cancer activated kinase,BTAK/Aurora-A)多被检测出在肿瘤细胞中有高水平的表达,同时它也参与并调节DNA损伤、参与有丝分裂、胞质分裂,近年来又有研究表明,Aurora-A参与细胞内分子的转录,通过以上行为方式,Aurora-A参与诱导肿瘤的产生。曾有实验室发现,Aurora-A与BRCA2会相互抑制而关联于乳腺癌的发生、增殖和转移中。基于以上报道,我们进行了进一步深入的研究。研究目的:经大量文献查阅发现,BRCA2在一些蛋白的诱导下会发生磷酸化,磷酸化后的BRCA2会发生结构上的变化,而失去了与一些相关蛋白发生偶联的能力,进而导致其抑制肿瘤的能力也发生变化。同时Aurora-A激酶会通过诱导抑癌基因P53等翻译后蛋白的磷酸化来诱导癌症发生。上面也提到,Aurora-A与BRCA2通过彼此反向调节来作用于癌症。本实验为了深入研究Aurora-A与BRCA2在肿瘤细胞内的作用机理,推测并逐步验证二者是否通过磷酸化来相互作用,以及二者磷酸化后是否会调节细胞的功能甚至机体功能。由于时间有限和尝试步骤的繁琐,本论文截至时间实验只进行到检测出其磷酸化发生的大概位置,至于磷酸化发生的具体氨基酸位点、以及磷酸化过程是否是诱导二者负调控的主要原因还有待进一步的研究。研究方法及结果:本实验通过原核细胞内的蛋白体外表达技术,成功诱导了BRCA2、Aurora-A、P53蛋白的表达。表达成功后分别构建了Aurora-A与P53(阳性对照)、Aurora-A与BRCA2两对蛋白质间体外磷酸化反应体系。最后成功在体外构建了各体外纯化蛋白、检测出了适宜的磷酸化反应体系,并最终验证出BRCA2受Aurora-A在磷酸化体系中诱导后,于其序列靠近C端3064-3208位点之间的苏氨酸(threonine/thr)上发生磷酸化。本实验包括以下四个部分:1.BRCA2的体外分段扩增本实验首先运用PCR技术、以设计好的两端带有Not I和Sal I两个酶切位点(这两个酶切位点载体上有而BRCA2片段上没有)的16对引物将BRCA2以扩增的形式分成大小不等的16段。并将酶切后的16段BRCA2片段分别与酶切后的原核载体PGEX-4T3连接,让其粘性末端结合,重新交叉重组,构建重组原核质粒。随后以BL21原核杆菌为基因复制载体,运用转化等技术手段将16个重组质粒导入原核细胞BL21中,并在适宜条件下培养促进重组质粒在原核细胞中的大量复制。最后用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)在不同条件下诱导蛋白的表达,通过蛋白印迹法(western blot)用GST抗体检测16个PGEX-4T3-BRCA2-fragment1~16重组质粒在不同条件下表达的蛋白量,并筛选出最优条件。通过以上实验,我们成功诱导表达出16个PGEX-4T3-BRCA2-fragment 1~1重组质粒的蛋白,且为每一个片段找到了能表达最优蛋白量的条件。2.Aurora-A激酶诱导P53磷酸化已有研究明确表明,Aurora-A会诱导P53蛋白于丝氨酸(serine/ser)315位点发生磷酸化,所以我们选择Aurora-A与P53蛋白的磷酸化反应作为检测磷酸化体系有效性的阳性对照。本实验同样用第一部分中的方法构建了以PGEX-4T3为载体的PGRX-4T3-P53-WT(野生型)和R175H(突变型)两种原核重组质粒,PGEX-4T1-Aurora-A-WT(野生型)、KDTD(突变型)、T288D(突变型)是实验室之前已经构建好的。随后也用IPTG以不同条件诱导以上蛋白的体外表达,同样采用western blot检测手段用GST抗体验证蛋白表达是否成功。通过综合大量的文献,本实验选定了一种可行磷酸化反应体系作为拟反应体系,用Aurora-A和P53原核表达蛋白的磷酸化反应对该拟反应体系进行了初步实验。在该磷酸化体系反应结束后,用SDS样品缓冲液终止反应,并用phospho-P53(Serine-315)和phospho-Aurora-A(Threonine-288)抗体进行western blot技术检测。以上结果显示:首先,该实验成功筛选出不同片段蛋白表达的最优条件,并成功诱导表达了PGEX-4T1-Aurora-A-WT、KDTD、T288D和PGEX-4T3-P53-WT、R175H质粒的蛋白体外表达;其次,通过磷酸化蛋白的验证,证明该磷酸化体系有效,可用于第三部分Aurora-A对BRCA2的磷酸化诱导。3.Aurora-A激酶诱导PGEX-4T3-BRCA2-fragment 1~16的磷酸化基于以上磷酸化体系诱导磷酸化反应有效,本部分用该磷酸化体系进行Aurora-A诱导16个PGEX-4T3-BRCA2-fragment 1~16蛋白的磷酸化反应。首先将Aurora-A分别与16个PGEX-4T3-BRCA2-fragment 1~16原核重组质粒的表达蛋白在磷酸化体系下磷酸化,并以PGEX-4T3-BRCA2-fragment 1~16相同磷酸化体系但不加Aurora-A作为阴性对照,磷酸化反应结束后同样用SDS样品缓冲液终止反应。最后用phospho-serine和phospho-threonine抗体通过western blot技术检测磷酸化的发生情况。结果表明,PGEX-4T3-BRCA2-fragment 15在Aurora-A诱导下发生了磷酸化,且其磷酸化氨基酸位点为苏氨酸。4.对PGEX-4T3-BRCA2-fragment 15进行再分段并检测磷酸化水平基于第三部分已经确定了磷酸化发生于2950-3208位点之间,我们对该区间进行再分段,根据蛋白结构和AT-GC含量将其分为两段,并分别与原核载体连接,经过上述同样的方法诱导蛋白的体外表达,以及进行磷酸化,对比两个片段的磷酸化水平。我们发现,在PGEX-4T3-BRCA2-fragment 15-2上发生了明显的磷酸化,由此,我们进一步缩小了磷酸化发生的范围为靠近C端3064-3208位点之间。研究结论:实验表明,在体外的一定条件下,BRCA2的确会在Aurora-A的诱导下发生磷酸化,且我们验证出磷酸化发生的位点为BRCA2蛋白的3064-3208位点之间,即靠近C端的苏氨酸上。由此,我们可以初步推测,BRCA2在Aurora-A激酶作用下于其近C端发生磷酸化。BRCA2与RAD 51的结合也是C端,所以该位点的磷酸化是否会影响BRCA2的功能,比如影响其与RAD 51的联合作用,从而影响乳腺癌的发生和发展还有待进一步的研究。
[Abstract]:In order to study the role of Aurora - A and BRCA2 in the pathogenesis of breast cancer , it has been found that Aurora - A and BRCA2 are involved in the genesis , proliferation and metastasis of breast cancer . In this experiment , it has been found that Aurora - A and BRCA2 are involved in the genesis , proliferation and metastasis of breast cancer . In this experiment , we have successfully induced the expression of recombinant plasmid p53protein in prokaryotic cell BL21 . We found that BRCA2 was phosphorylated under the induction of Aurora - A .

【学位授予单位】：上海师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R730.2

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本文编号：1701460