癌胚性长链非编码RNA Ptn-dt在小鼠肝癌中的作用和机制研究

发布时间：2018-04-02 17:32

本文选题：肝细胞癌　切入点：癌胚基因　出处：《第二军医大学》2017年硕士论文

【摘要】：原发性肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC,以下简称肝癌)是世界范围内发病率最高的恶性肿瘤之一。尽管针对肝癌病人的治疗方法在不断完善,治疗策略在不断提高,但是病人的5年生存率依然很低。一个很重要的原因就是人们对肝癌发生发展的具体机制认识不清,缺乏肝癌早期诊断的有效手段,使得大量处于肝癌早期的病人不能得到及时诊断,从而失去了治疗的最佳时机。因此,深入对HCC发生、发展过程中分子机制的研究,寻找可用于HCC诊断的更有效的标志分子,是一件刻不容缓的工程。长链非编码RNA(lncRNAs)是一类转录本长度大于200个核苷酸的RNA分子。近几年的研究显示,lncRNAs在肝癌的发生发展过程中发挥着重要的调控作用。此外,早在20世纪70年代,已经有科学家提出肿瘤的发生过程模拟胚胎发育的过程,例如,在胚胎期特异性高表达的甲种胎儿球蛋白就是目前肝癌诊断和预后评估最有效的标志分子。因此本课题以“癌胚性”为切入点,通过对小鼠胎肝组织和肝癌组织中同时高表达的lncRNAs进行筛选和功能研究,寻找更多可用于肝癌诊断和治疗的标志性的lncRNAs分子。在本研究中,我们从小鼠的胎肝组织、成肝组织和肝癌组织的lncRNAs芯片中,发现了大量差异表达的lncRNAs分子。我们将在成年期不表达,而在胚胎期和肿瘤期同时高表达的这一类lncRNAs分子称为癌胚性的lncRNAs分子。从多个候选癌胚性的lncRNAs分子中,我们靶定了一个新的癌胚性的lncRNA分子,根据其与邻近编码基因(Pleiotrophin,Ptn)的位置关系,我们将其命名为lncRNA Ptn-dt(Pleiotrophin downstream transcript),以下简称为Ptn-dt。我们利用real-time PCR、Northern blot和RNA荧光原位杂交技术(RNA FISH),明确了Ptn-dt的癌胚特性,同时,Northern blot的结果显示,Ptn-dt独立存在于小鼠的转录组中,RNA FISH的结果显示,Ptn-dt主要分布在细胞质中。之后,我们利用5’,3’RACE技术,获得了Ptn-dt的转录本全长。在小鼠的肝癌细胞系Hepa1-6细胞中,分别构建了Ptn-dt过表达和干扰Ptn-dt表达的稳转细胞系。通过一系列的体内外功能实验,发现,Ptn-dt具有促进小鼠肝癌细胞增殖的作用。在明确Ptn-dt促进小鼠肝癌细胞增殖的基础上,我们又对Ptn-dt的作用机制进行了初步探索。通过RNA pulldown实验和RNA免疫共沉淀(RIP)实验,发现,Ptn-dt与HuR蛋白之间存在相互作用关系。研究报道,HuR是一个RNA结合蛋白,可以稳定许多RNA分子,并调控其转录。同时RIP的结果证实,HuR蛋白与miR-96之间存在相互作用关系。而我们的研究发现,Ptn-dt的过表达可引起miR-96下调表达。已有研究报道,真菌天然产物azaphilone-9与HuR的结合能够在体外抑制HuR与RNA分子之间的相互作用。由此我们推测,Ptn-dt与HuR的结合,可能影响了HuR与miR-96的结合,从而使得miR-96的稳定性降低,表达水平减低。随后,在miR-96众多的靶分子中,我们发现Alk(Anaplastic lymphoma kinase)是Ptn的受体蛋白。研究报道,Ptn对其受体Alk有激活作用,而且Ptn可通过Alk促进肿瘤的生长和血管异常的发生。同时,我们的研究发现,Ptn-dt的过表达,可促进Alk在mRNA水平以及蛋白水平的表达。因此,根据以上研究结果和研究报道,我们初步推断:Ptn-dt与HuR的结合,可能影响了HuR与miR-96的结合,使得mi R-96的稳定性降低,表达减少,从而减弱了miR-96对Alk的转录后抑制作用。最终,Alk表达增加,增强了Ptn的生物学功能,从而实现了Ptn-dt的促增殖作用。简而言之,癌胚分子Ptn-dt可能是通过HuR/miR-96/Alk通路和pleiotrophin-Alk轴来实现自身的促增殖作用的。概括来讲,本研究首次报道了Ptn-dt在肝癌中的促增殖作用,并对Ptn-dt的作用机制进行了初步探索。因此,本研究补充了lncRNAs在肝癌中的功能和机制研究,为人类肝癌分子机制的研究提供一定的参考价值。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.7

【参考文献】