急性髓系白血病干细胞新靶点3A4抗原的生物学特性研究

发布时间：2018-04-02 20:21

本文选题：白血病干细胞　切入点：急性髓细胞白血病　出处：《浙江大学》2015年博士论文

【摘要】：目的研究认为白血病患者体内存在一群极微量的细胞群,这些细胞通常对化疗药物不敏感,能够逃逸化学药物的杀伤作用；同时具有一定的自我更新能力使其可以在体内维持白血病的生成,从而成为白血病复发和耐药的根源。这群白血病细胞被称为白血病干细胞(Leukemia stem cells, LSCs)。只有有效清除LSCs,才能从根本上治愈白血病。发现并研究LSCs上特异性表达的分子抗原,对LSCs的生物学特性研究以及白血病治疗都具有重要意义。前期实验初步表明,本实验室自行研制的3A4单克隆抗体对急性髓系白血病干细胞(CD34+CD38-CD123+)具有较强的识别能力。在此基础上,我们对3A4单抗靶向的3A4抗原的生物学特性进行全面和深入的分析,探讨3A4抗原作为AML LSCs靶点的可能性,为白血病靶向治疗提供新的途径。本课题进行了如下四个部分内容的研究：(1)3A4抗原表达规律的分析；(2)3A4抗原表位的研究；(3)3A4抗原相关干细胞特性的研究；(4)3A4-高三尖杉酯碱抗体偶联物的制备及其靶向杀伤活性检测。方法 13A4抗原表达规律的分析 1.13A4及相关抗原在白血病干细胞及各亚群细胞上的表达：(1)流式细胞术检测3A4抗原、3A4的相关同型抗原(CD45RA、CD45和CD45RO)以及干／祖细胞相关抗原(CD33、CD44、CD123、CD133、CD19和HLA-DR)在儿童白血病患者骨髓LSCs、正常造血干细胞(Hematopoietic stem cells, HSCs)及各亚群细胞上的表达情况。其中ALL37例(31例B-ALL,6例T-ALL), AML54例(4例M0-M1,14例M2,5例M3,29例M4-M5,2例M6),CML6例。11例特发性血小板减少性紫癜(Idiopathic thrombocytopenic purpura, ITP)患者作为对照。(2)流式细胞术检测3A4抗原及上述抗原在10例AML和10例B-ALL复发白血病患者骨髓白血病细胞上的表达。(3)细胞定义：LSCs和HSCs以CD34+CD38-Lin-细胞群定义,各亚群细胞分别指CD34-、CD34+CD38+、 CD34+CD38-和CD34+CD38-Lin-细胞。 1.23A4抗原在多器官正常组织和肿瘤组织的分布情况：通过组织微阵列技术结合免疫组化法检测3A4抗原在99例多器官正常组织和96例多器官肿瘤组织上的表达。 23A4抗原表位的研究 2.1CD45RC各截短型真核表达载体的构建及表达：根据CD45基因6号外显子基因序列(CD45RC)构建4个不同的截短型真核表达载体,分别命名为pcDNA3.1+/CD45RC-1(包含6号外显子前99bp)、pcDNA3.1+/CD45RC-2(包含6号外显子后99bp)、pcDNA3.1+/CD45RC-3(包含6号外显子前48bp)和pcDNA3.1+/CD45RC-4(包含6号外显子后48bp)；将空载体pcDNA3.1+、未截短型pcDNA3.1+/CD45RC以及构建成功的上述4个截短型真核表达载体分别经转染级抽提试剂盒抽提质粒后,经LipofectamineTM2000试剂盒采用脂质体转染法将上述质粒DNA转染CHO细胞；通过RT-PCR检测转染后CHO细胞目的基因的表达；采用流式细胞术和Western blot检测转染后CHO细胞膜上的CD45RC各截短体蛋白的表达情况。 2.2表位肽扫描法测定3A4抗原表位：根据CD45基因6号外显子编码的氨基酸序列采用固相合成法合成一条多肽片段(序列为DVPGERSTAS TFPTDPVSPL TTTLSLAHHS SAALPARTSN TTITANTSD);采用质谱法(Mass spectrometry, MS)及高效液相色谱法(High performance liquid chromatography, HPLC)检测合成的多肽抗原的正确性及纯度；根据间接酶联免疫吸附分析法(Indirect enzyme linked immunosorbent assay, iELISA)分析该抗原多肽与3A4抗体的结合能力。 33A4抗原相关干细胞特性研究 3.1体外实验测定3A4抗原相关干细胞特性：间接免疫磁珠法分选3A4阳性和3A4阴性Kasumi细胞和HL60细胞；BrdU渗入法标记3A4阳性和3A4阴性白血病细胞的增殖状态；CCK-8法和Annexin V-PI染色法检测化疗药物作用下3A4阳性和3A4阴性白血病细胞的增殖状态和抗凋亡能力。 3.2体内实验测定3A4抗原相关干细胞特性：通过3A4抗体封闭白血病细胞株(KGla细胞和Nalm-6细胞)和人骨髓单个核细胞表面的3A4抗原,观察经过3A4抗体封闭和未封闭的两群细胞在NOD/SCID小鼠体内成瘤能力的差异；通过间接免疫磁珠法分选3A4阳性和3A4阴性的AML患者骨髓单个核白血病细胞,比较这两群细胞在NOD/SCID小鼠异体移植成瘤能力的差异。 43A4-HHT抗体偶联药物的制备及靶向杀伤活性检测： 4.13A4-HHT抗体偶联药物的制备：异型双功能交联剂(SPDP和SMCC)修饰3A4抗体的半胱氨酸(Cysteine, Cys)富含的巯基(-SH)或赖氨酸(Lysine, Lys)残基富含的氨基(-NH2)；硫脲法将高三尖杉酯碱(Homoharringtonine, HHT)的末端羟基(-OH)巯基化；修饰后的3A4抗体与巯基化HHT4℃过夜结合反应：BCA测定3A4-HHT偶联药物蛋白浓度；流式细胞仪测定3A4-HHT偶联药物的活性。 4.23A4-HHT抗体偶联药物靶向杀伤活性检测：采用CCK-8细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒检测不同浓度(0、1、2、4、8、16、32μg/ml)3A4-HHT抗体偶联药物在不同作用时间(24h、48h和72h)下对KG1a细胞和Nalm-6细胞的靶向杀伤活性。结果 13A4抗原表达规律的分析 1.13A4及相关抗原在白血病干细胞及各亚群细胞上的表达：(1)3A4抗原在AML LSCs上的表达水平明显高于HSCs,中位表达水平分别为94.8%vS.21.8%,P0.0001；且3A4抗原在54例AML患者的LSCs上均为阳性表达。(2)3A4抗原在AML和B-ALL复发白血病患者的白血病细胞上具有较强的表达,中位表达水平分别为(90.94±4.9)%和(81.74±9.1)%。(3)3A4抗原在各亚型AML LSCs上的表达水平分别为(92.3±3.3)%[M0-1]、(95.1±1.5)%[M2]、(46.4±13.8)%[M3]、(85.2±4.3)%[M4-5]和(61.2士28.9)%[M6],以MO-1和M2型白血病上的抗原表达水平最高。(4)3A4抗原在正常CD34+CD38+细胞上较其他细胞亚群(CD34+CD38-和CD34+CD38-Lin-)相对高表达,而在AML CD34+CD38+、CD34+CD38-和CD34+CD38-Lin-各细胞群上的表达无明显差异。(5)3A4抗原在AML LSCs和HSCs上的表达选择性明显高于CD33、CD123、CD133、CD44和HLA-DR抗原。 1.23A4抗原在多器官正常组织和肿瘤组织器官的分布情况：(1)3A4抗原主要在脾脏、扁桃体和胸腺等淋巴组织器官上表达,在甲状旁腺、小肠、结肠、胃等组织上主要限制表达于淋巴组织处,在重要器官组织(如脑、心、肝、肺、肾、生殖器官)上基本不表达。(2)3A4抗原主要在肠、脾、甲状腺、淋巴结等淋巴组织处发生的B细胞性淋巴瘤、B细胞性细胞瘤、何杰金氏淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤上高表达,在T细胞性淋巴瘤上基本不表达。 23A4抗原表位的研究 2.1CD45RC各截短型真核表达载体的构建及表达：(1)真核表达载体pcDNA3.1+/CD45RC-1、pcDNA3.1+/CD45RC-2、pcDNA3.1+/CD45RC-3和pcDNA3.1+/CD45RC-4经摇菌扩增提取质粒DNA后,酶切及测序结果显示构建的载体分别包含相应的目的基因片段,表明CD45RC的4个截短型真核表达载体构建成功。(2)RT-PCR结果显示转染后的各截短型CD45RC CHO细胞中存在CD45基因表达,表明各转染的CHO细胞在转录水平上成功表达CD45基因,转染后细胞分别命名为CD45RC-1CHO、CD45RC-2CHO、CD45RC-3CHO和CD45RC-4CHOO(3)流式细胞术结果发现,4个截短型CD45RC CHO细胞均可检测到3A4抗原的表达,表达水平分别为(36.7+6.9)%、(35.2+13.3)%、(43±7.9)%和(41.4+14.2)%,各组间均无明显统计学差异(P值均0.05)。而Western blot法在CD45RC-1CHO、CD45RC-2CHO、CD45RC-3CHO和CD45RC-4CHO细胞上未能检测到3A4抗体识别的抗原。 2.2表位肽扫描法测定3A4抗原表位：MS结果显示合成的多肽抗原分子量为4996.5,与理论分子量4996.35相近,从分子量水平上提示多肽合成正确；HPLC检测结果显示,合成的多肽抗原纯度为70%左右,符合下一步实验要求；iELISA结果显示,3A4抗体不能识别CD45基因6号外显子编码的氨基酸线性序列,提示3A4抗原表位可能为构象型表位。 33A4抗原相关干细胞特性研究 3.1体外实验测定3A4抗原相关干细胞特性：3A4阳性Kasumi细胞和HL60细胞的增殖能力分别低于相应3A4阴性Kasumi细胞和HL60细胞的增殖能力,BrdU的表达水平分别为(4.6±1.9)%vs.I(35.1+1)%,(P0.05)和(44.9士1.3)%vs.(74.4±2)%,(P0.05); IC50和IC70作用浓度下的THP和Ara-C对3A4阳性Kasumi细胞和HL60细胞的抑制率均低于相应3A4阴性细胞(P值均0.05),而IC50和IC70浓度下的HHT对这两群细胞的抑制率均无明显差异(P值均0.05)；在THP和Ara-C作用下,3A4阳性Kasumi细胞和HL60细胞的抗凋亡能力均高于相应的3A4阴性白血病细胞,而在HHT作用下两者的抗凋亡能力无明显差异。 3.2体内实验测定3A4抗原相关干细胞特性：经尾静脉注射5×106个Nalm-6细胞后,3A4抗体孵育组小鼠和鼠IgG抗体孵育组小鼠在植入15天以后,均开始出现行动迟缓,消瘦、后肢瘫痪或弓背等情况,流式和病理结果显示小鼠体内存在白血病细胞浸润,中位发病时间分别为18和22天。经尾静脉注射5×106个KGla细胞后,鼠IgG抗体孵育组小鼠均生成白血病,成瘤率为100%(3/3),中位发病时间为58天；3A4抗体孵育组小鼠生存状态良好。 43A4-HHT抗体偶联药物的制备及靶向杀伤活性检测：BCA测定3A4-SPDP-HHT和3A4-SMCC-HHT偶联物的蛋白浓度分别为0.2mg/ml和0.3mg/ml;流式结果显示3A4-SPDP-HHT和3A4-SMCC-HHT对KGla细胞的识别能力与裸抗3A4无明显差异,分别为98.89%和94.68%；CCK-8结果显示,在不同观察时间和药物浓度作用下,3A4-SPDP-HHT和3A4-SMCC-HHT对Nalm-6细胞的抑制率均明显低于KGla细胞(P值均0.05),说明3A4-SPDP-HHT和3A4-SMCC-HHT对靶细胞KGla具有良好的选择性杀伤作用。其中,3A4-SPDP-HHT和3A4-SMCC-HHT随着作用浓度增加,对细胞的抑制作用亦逐渐增强,但不呈时间依赖性。结论 1.3A4抗原选择性地高表达于AML LSCs,以M0-1和M2类型白血病最为明显,而在正常HSCs上弱表达。3A4抗原在AML LSCs和HSCs上的表达选择性明显高于CD33、CD123、CD133和CD44等抗原分子。此外在复发AML患者的骨髓白血病幼稚细胞上同样具有较强的表达水平。 2.3A4抗原主要在淋巴相关组织器官及淋巴细胞上表达,在重要器官组织(如脑、心、肝、肺、肾和生殖器官等)上基本不表达。 3.3A4抗原表位主要为CD45基因6号外显子编码的蛋白区域,可能是构象型表位。 4.3A4抗原阳性的HL60细胞和Kasumi细胞较相应的3A4阴性细胞耐药及抗凋亡能力更强,一定程度上反映了3A4阳性白血病干细胞的特性。 5.3A4抗体可以有效抑带KG1a细胞在NOD/SCID小鼠体内成瘤。 6.成功制备3A4-SMCC-HHT和3A4-SPDP-HHT抗体偶联物,体外显示良好的靶向杀伤效应。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R733.71

【参考文献】