microRNA16及其靶基因Wip1在胶质瘤细胞及其干细胞增殖、侵袭中的作用

发布时间：2018-04-03 05:04

本文选题：胶质母细胞瘤　切入点：miR-16　出处：《安徽医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：背景和目的:胶质母细胞瘤是脑肿瘤中最常见的致死性肿瘤,是一种多基因异常疾病,涉及大量信号通路的调控和多个基因的表达异常[1-3],其中也包括mi RNAs对基因表达的精准调控[4-5],但详细机制不十分清楚。尽管采取综合性治疗及靶向治疗,其患者中位生存期仍不足15个月。肿瘤干细胞理论认为肿瘤干细胞是恶性肿瘤复发的根源。因而研究胶质母细胞瘤细胞及干细胞生长和侵袭的分子机制具有重要的临床价值,可以促进更有效的治疗手段或药物的研发,有望提高患者的生存期。micro RNAs(mi RNAs)是一类由内源性基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子,按其功能可分原癌基因功能的mi RNAs、抑癌基因功能的mi RNAs和调控干细胞功能的mi RNAs,他们在肿瘤发生或发展中通过多种分子机制参与经典的遗传学和表观遗传学调控[6-7]。胶质瘤相关mi RNAs研究中,具有原癌基因功能的有mi R-21、mi R-221/222、mi R-10b、mi R-17-92基因簇等[8-10],具有抑癌基因功能的有mi R-128、mi R-34a、mi R-7、mi R124/mi R-137d[11-12]等。mi R-16首次发现在慢性淋巴细胞白血病中低表达,可能具有抑癌基因的功能[13]。迄今已发现多种调节胶质瘤干细胞(Glioblastoma stem cells,GSCs)和神经干细胞的stem-mi Rs,参与调控BMPs(形态形成蛋白)、SHH(Sonic hedgehog通路)和NOTCH等多条信号通路,其中调控GSCs增殖和分化的有mi R-124、mi R-135b和mi R-37等[14-15];调控自我更新的有mi R-7、mi R-9、mi R-34a、mi R-124、mi R-128、mi R-326和mi R-451等[16];调控化疗耐药和放疗抵抗的有mi R-181b[17]等。本课题组前期实验研究结果证实在胶质瘤组织和细胞系中mi R-16均显著低表达,可能与胶质瘤的发生相关。通过对micro RNA.org、Targetscan和mi R Walk数据库的分析,预测Wip1可能是mi R-16的靶基因之一。Wip1(wild-type p53-induced phosphatase 1,野生型p53诱导的磷酸酶1基因)是近年发现的一种原癌基因,研究发现在多种肿瘤中高表达,与肿瘤的增殖和预后相关,可以通过作用于其下游靶基因p53以及Wip1-p53通路参与细胞周期和细胞凋亡过程,且与肿瘤的放疗抵抗、化疗耐药及预后不良相关[18-19]。有研究显示p53与胶质瘤及其肿瘤干细胞关系密切[20-21],但其调控机制尚未明确。基于此,本研究试图通过上调胶质母细胞瘤细胞U87和U251及其干细胞中的mi R-16,以探讨mi R-16对胶质母细胞瘤增殖和侵袭等生物学功能的影响,以及mi R-16调控Wip1-p53通路的机制,进一步深入解析mi R-16及其靶基因在胶质母细胞瘤中的抑癌作用。方法:胶质母细胞瘤U87和U251及其干细胞(GSC-U87和GSC-U251)的培养;干细胞分化实验及免疫荧光染色方法鉴定干细胞;Lipfectamine2000脂质体法将化学合成的mi R-16寡核苷酸随机序列(mi R-16 mimics和mi R-16 mimics negative control)转染到人脑胶质母细胞瘤细胞株U87和U251及其干细胞中,构建mi R-16过表达的胶质母细胞瘤细胞和干细胞模型;q RT-PCR技术检测转染细胞中后mi R-16、Wip1和p53 m RNA表达情况;平板克隆和Ed U实验检测mi R-16对细胞的生长、增殖影响,流式细胞仪检测mi R-16对细胞的凋亡和周期的影响;Transwell侵袭和划痕实验检测mi R-16对细胞迁移、侵袭能力的影响;双荧光素酶报告基因实验验证mi R-16与Wip1 3’-UTR的关系;Western blot技术检测mi R-16的预测靶基因Wip1及其下游基因p53的蛋白表达水平。结果:胶质瘤细胞干细胞培养,分化后的细胞表达GFAP,CD133和Nestin失表达,而GSC-U87和GSC-U251细胞表达CD133和Nestin,GFAP失表达,表明本实验培养的GSC-U87和GSC-U251细胞为胶质瘤干细胞;转染mi R-16 mimics后mi R-16的表达显著升高,Wip1 m RNA及蛋白表达降低,p53 m RNA及蛋白表达升高;过表达mi R-16使U87和U251细胞及其干细胞生长增殖和侵袭能力下降,G1期细胞增多,S期细胞减少,细胞早期凋亡率增加。结论:mi R-16抑制U87和U251细胞及其干细胞的增殖和侵袭能力,促进凋亡发生;mi R-16通过抑制其靶基因Wip1的表达而使p53高表达,从而在胶质母细胞瘤中发挥抑癌作用。
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【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R739.41

【参考文献】