INSR和GPCR信号通路串话激活胰腺癌细胞内YAP机制研究

发布时间：2018-04-03 18:13

  本文选题：胰腺癌　切入点：Insulin/IGF-1　出处：《天津医科大学》2017年博士论文

【摘要】：背景:胰腺癌是目前公认的恶性度极高的消化系统肿瘤,也是当前研究的主要社会健康问题之一。在肿瘤发生发展过程中,相关信号通路上游因子通过级联反应刺激下游底物,影响组织细胞生长、增殖、凋亡和迁移等,发挥生物学作用。G蛋白偶联受体和胰岛素受体是已知的两大细胞膜受体,介导胞外信号向胞内的传递。有研究证实胰腺癌细胞株内存在大量变异G蛋白偶联受体及其激动剂,相关信号系统与胰岛素生长因子受体信号通路协同在有丝分裂过程中发挥至关重要的作用。YAP是Hippo信号通路下游主要转录因子和特定环境下的致癌基因,对GPCR和Insulin/IGF-1刺激相对较为敏感。目前已逐渐认识到在胰腺肿瘤组织中存在YAP和TAZ的过表达状态,但GPCR和Insulin/IGF-1信号串话对胰腺癌中YAP的调控尚无报道。目的:1、明确GPCR和Insulin/IGF-1串话对胰腺癌细胞株内YAP核质移位、磷酸化和转录活性的影响;2、探索PI3K/Akt/mTOR在GPCR和Insulin/IGF-1细胞信号通路串话中对胰腺癌细胞内YAP的调控作用;3、研究PKD在GPCR和Insulin/IGF-1通路系统对胰腺癌细胞株内YAP活性的影响;4、明确他汀类药物在胰腺癌细胞生长增殖中的影响及对YAP的调控。方法:1、免疫荧光技术检测正常生长和经GPCR及Insulin/IGF-1激动剂处理的Panc-1、MiaPaCa-2胰腺癌细胞株内YAP核质定向迁移情况;Western Blot监测处理前后YAP Ser127磷酸化水平;qRT-PCR技术检测激动剂处理前后YAP-TEAD下游转录相关因子mRNA的水平表达;使用激动剂处理YAP和TAZ特异性siRNA转染的细胞,观察YAP下游相关因子表达、蛋白磷酸化水平,[3H]-Thymidine Incorporation检测细胞内DNA合成情况等;克隆形成、细胞增殖计数观察激动剂处理YAP和TAZ特异性siRNA转染的细胞生长数天后的生长增殖情况。2、应用PI3K和mTOR抑制剂A66(梯度浓度)和KU63794干预细胞,qRT-PCR检测激动剂处理与未处理的细胞下游相关因子mRNA表达水平,Western Blot监测处理前后pAktThr308和p70S6KThr389磷酸化水平;向细胞内转染GFP标记的AKT-PH质粒,应用梯度浓度的A66预处理细胞,荧光显微镜观察处理组和对照组在GPCR和Insulin/IGF-1激动剂neurotensin和insulin刺激下PIP3的细胞膜敏感性和AKT-PH的动态变化过程。3、应用PKD抑制剂CRT0066101(梯度浓度)和kb142-70干预细胞,通过qRT-PCR检测激动剂处理与未处理的细胞YAP下游相关因子mRNA表达水平,Western Blot免疫蛋白印迹法检测PKD pSer916磷酸化水平;实时定量PCR检测应用激动剂处理的PKD1、PKD2和PKD3特异性siRNA转染的胰腺癌细胞下游相关靶基因表达,免疫蛋白印迹法进一步观察蛋白的磷酸化水平。4、细胞增殖计数和细胞的克隆形成实验检测他汀类药物在胰腺癌细胞生长增殖过程中的影响;qRT-PCR检测在他汀类药物处理前后的胰腺癌细胞YAP-TEAD下游相关靶基因的表达水平。结果:1、免疫荧光法观察密集生长的胰腺癌细胞株使用GPCR和Insulin/IGF1激动剂neurotensin和insulin刺激30min/60min后,发现细胞质内的YAP有向细胞核内迁移的趋势;免疫蛋白印迹法监测到激动剂联合刺激后YAP Ser127明显脱磷酸化;激动剂处理后的细胞YAP/TEAD下游CTGF、Cyr61和CXCL5等相关因子mRNA表达水平升高;通过转染YAP和TAZ特异性siRNA下调YAP和TAZ水平能显著降低激动剂诱导的细胞内YAP/TEAD下游CTGF、Cyr61和CXCL5等相关因子mRNA表达水平、YAP磷酸化水平、DNA的合成、细胞生长增殖数量和克隆数目。2、梯度浓度的PI3K抑制剂A66能不同程度抑制激动剂诱导的细胞pAktThr308磷酸化水平;GPCR和Insulin/IGF1激动剂neurotensin和insulin处理AKT-PH-GFP转染的细胞后,PIP3在细胞膜聚集明显,浓度梯度的A66可不同程度地抑制PI3K介导的PIP3细胞膜敏感性;不同剂量的A66不同程度影响激动剂处理的细胞YAP下游靶基因mRNA水平表达,mTOR抑制剂KU则在处理前后无明显差异。3、PKD抑制剂CRT0066101和kb142-70能抑制激动剂诱导的细胞YAP/TEAD下游相关因子mRNA表达水平和PKD pSer916磷酸化水平,且磷酸化水平与CRT0066101呈剂量依赖性;通过转染PKD1、PKD2和PKD3特异性siRNA下调PKD水平对YAP下游靶基因mRNA水平和PKD磷酸化存在影响。4、他汀类药物明显抑制胰腺癌细胞生长增殖,抑制经过激动剂诱导处理的细胞YAP下游靶基因mRNA水平下降,他汀类药物处理后在PKD pSer916磷酸化水平表达存在存在剂量的依赖性。结论:1、GPCR和Insulin/IGF-1串话对胰腺癌细胞YAP核质移位、磷酸化水平和转录活性存在关键作用,而特异性的敲除YAP可有效抑制胰腺肿瘤细胞的生长增殖,可能成为未来肿瘤治疗的新靶点。2、GPCR和Insulin/IGF-1通路串话系统通过PI3K对下游YAP进行调控,通过特异性的抑制PI3K可有效降低YAP的相关生物学活性,进而影响胰腺癌的发生进展相关过程。3、特异性的抑制或敲除PKD对YAP活化存在影响,PKD是GPCR和Insulin/IGF-1通路系统对YAP调控的关键上游因子。4、他汀类药物通过甲羟戊酸途径抑制YAP活性,可有效控制胰腺癌细胞的生长增殖,具体信号通路间的相互刺激与抑制有待未来进一步研究。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.9

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本文编号：1706339