前列腺癌和肾癌中分子标志物的研究

发布时间：2018-04-15 22:17

  本文选题：前列腺癌 + PCAT14　； 参考：《山东大学》2016年博士论文

【摘要】：引言血清PSA筛查的普及极大的提高了前列腺癌的检出率,同时也造成了前列腺癌的过度诊疗。新型前列腺癌诊断标志物如长链非编码RNA PCA3和融合基因TMPRSS2-ERG,虽然能够提高前列腺癌诊断的特异性,却无预后价值。目前临床上综合各项临床病理特征进行病人的风险分级和制定诊疗策略。然而这种风险分级方式尚不够精确,远不能满足个体化诊疗的需求。因此,研究能够鉴别惰性和进展性前列腺癌的预后分子标志物仍旧是在前列腺癌临床基础研究方面的一大挑战。得益于新一代测序技术的迅猛发展,人们对肿瘤转录本有了更加全面的认识,特别是占人类基因组80%以上的非编码RNA。其中一类长度大于200nt的非编码RNA称为长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)。lncRNA且备特殊的组织特异性和肿瘤特异性的表达谱,越来越多的研究支持lncRNA作为一类潜在的分子标志物。本研究中我们利用已发表的RNA-Seq数据库,包括TCGA, SU2C等,系统全面的分析了与惰性前列腺癌和恶性进展性前列腺癌相关的基因(包括编码基因和非编码基因),并发现了一个新的lncRNA PCAT14。PCAT14在前列腺癌组织中有较高的表达水平,具备前列腺组织和肿瘤特异性的表达谱,且与前列腺癌的低Gleason分级相关。我们进一步阐明了PCAT14的基因结构及表达调控,并应用大样本量前列腺癌队列评价了PCAT14作为分子标志物在前列腺癌中的诊断和预后价值；其次我们开发出一种新的RNA-ISH技术可在临床前列腺癌FFPE标本中检测PCAT14的表达,极大的扩展了PCAT14的临床应用前景；最后,我们应用细胞实验初步探究了其在前列腺癌中的生物学作用。研究目的1.系统寻找前列腺癌中潜在的分子标志物。2.研究PCAT14作为分子标志物在前列腺癌中的诊断和预后价值。3.探究PCAT14在前列腺癌中的生物学作用机制。研究方法1.提取TCGA数据库中前列腺癌RNA-Seq数据分析低Gleason分级(GS=6)与高Gleason分级(GS=9+)之间差异性表达的基因。2.运用cDNA末端快速扩增技术、PCR技术和Sanger测序验证候选基因PCAT14在前列腺癌中的表达及PCAT14的基因结构。3.提取两个独立的前列腺癌外显子测序数据库John Hopkins cohort和Taylor's cohort,应用one-way ANOVA分析PCAT14在不同前列腺癌Gleason评分亚组间的差异性表达,应用工作者受试曲线(ROC)评价PCAT14诊断前列腺癌的灵敏度和特异性,用Kaplan-Meier生存曲线和多因素cox回归模型分析PCAT14诊断前列腺癌生化复发、肿瘤特异性进展、远处转移和总生存率的价值。4.应用CRISPR-dcas9/SAM系统或RNAi技术,以细胞增殖实验和细胞侵袭实验检测PCAT14在前列腺癌细胞中的生物学作用。研究结果1.PCAT14是与前列腺癌低Gleason评分(GS=6)相关的基因。2. PCAT14是前列腺癌肿瘤和组织特异性lncRNA。3. PCAT14位于22号染色体基因荒漠区,有3个异构体,其主要异构体有4个外显子。4. PCAT14是一个雄激素受体(AR)调控的基因。5.PCAT14启动子区域甲基化参与了其表达调控。6.受试者工作曲线(ROC)分析示PCAT14表达水平可鉴别出良性前列腺组织和前列腺癌组织,在TCGA前列腺癌数据库和Taylor cohort的曲线下面积(AUC)分别为0.837和0.823。7.在John Hopkin's cohort中,多因素cox回归模型生存分析示PCAT14可作为独立预后因子指示好的无生化进展生存率(BPFS,P=0.00126,HR=0.64),无转移生存率(MFS, P=0.000609; HR=0.52)和无进展生存率(PSS, P=0.0385; HR= 0.55)。8.在临床前列腺癌FFPE组织芯片中应用RNA-ISH染色示PCAT14在前列腺癌组织中高表达,在胞核和胞浆中分布基本相等,但在正常前列腺组织中不表达。9.以CRISPR-dcas9/SAM系统在前列腺癌细胞PC3和LNCaP中过表达PCAT14后进行细胞侵袭实验,结果示PCAT14过表达显著抑制PC3和LNCaP细胞的侵袭能力(所有P0.05)。研究结论1. PCAT14具备前列腺癌肿瘤特异性和组织特异性的表达谱,PCAT14的高表达与低Gleason分级显著相关。2. PCAT14表达受AR和启动子区域甲基化调控。3. PCAT14可作为前列腺癌的诊断标志物和预后标志物,可以联合各项临床病理参数更好的进行疾病的诊断和预后判断。4.我们开发了一种新型RNA-ISH技术可在前列腺癌FFPE组织检测PCAT14的表达,以鉴别良恶性前列腺组织。5. PCAT14的过表达可显著降低前列腺癌细胞的侵袭作用。肾透明细胞癌(ccRCC)是成人泌尿系肿瘤中最常见的恶性肿瘤,同时也是预后最差的泌尿系肿瘤。一旦发生远处转移,ccRCC患者五年生存率仅不足9%。因此,寻找可用于肾癌早期诊断和判断预后的生物学标志物是一项重要的临床和基础研究目标。Pontin与reptin是多种细胞活动相关的ATP酶(ATPase associated with diverse cellular activities)超家族中的一员,且在进化中序列高度保守。研究表明Pontin和reptin广泛参与了与肿瘤发生相关的染色质重构,转录调控,DNA损伤修复和snoRNA的生物合成等。我们的前期研究表明reptin在肾癌的恶性进展中发挥了重要作用,然而其同源异构体Pontin在肾癌中的表达及生物学作用尚不清楚。近期研究表明自然杀伤细胞(NK细胞)在抗肿瘤的固有免疫中发挥了重要的作用。NKG2D是NK细胞和CD8+细胞毒性T淋巴细胞上的一个激活受体,其配体MICA与NKG2D的结合将促进NK细胞和T淋巴细胞发挥抗肿瘤的细胞毒作用。MICA广泛表达于多种上皮来源性肿瘤,胞膜上MICA的表达将肿瘤细胞靶向NK细胞,并最终导致肿瘤细胞的死亡。多个研究表明MICA在结肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌和鳞状细胞癌中可作为预后因子。然而MICA在肾癌中的生物学作用及临床预后价值目前尚不清楚。本研究应用大样本量ccRCC组织标本探究Pontin和MICA在ccRCC中的表达及其临床预后价值,并以细胞学实验初步探讨了Pontin在ccRCC发生进展中的生物学作用和潜在的机制。研究目的1.评价Pontin在ccRCC中的表达和其临床预后价值,并探究其在肾癌细胞中的生物学作用及其潜在机制。2.评价MICA在ccRCC中的表达和其临床预后价值。研究方法1.应用实时定量RT-PCR、western blotting和免疫组化(IHC)技术在ccRCC临床标本中检测Pontin的表达。2.应用siRNA在肾癌细胞株A498,786-0和KRC/Y中降表达Pontin,以细胞划痕实验和transwell侵袭实验评估Pontin降表达对肾癌细胞迁移侵袭能力的影响。3.应用荧光免疫细胞组化技术检测Pontin对β-catenin亚细胞分布的影响,用实时定量RT-PCR检测Pontin对β-catenin下游靶基因c-myc和cyclinD1的影响。4.应用实时定量RT-PCR和IHC技术在ccRCC临床标本中检测MICA的表达。5.提取TCGA RCC RNA-Seq数据验证MICA在肾癌中的差异性表达。6.应用基因簇富集分析(GSEA)检测MICA高表达促进肾癌恶性进展的机制。研究结果1.相比于正常肾组织,Pontin mRNA和蛋白表达水平在ccRCC中显著上调(P=0.0016;P=0.0095)。E-cadherin蛋白的表达水平相较于正常肾组织显著下调(P0.001)。2.IHC示Pontin在91.6%ccRCC组织中表达阳性,在胞核及胞浆中均有分布；荧光免疫细胞组化示Pontin在肾癌细胞株A498和786-0中呈强阳性表达,主要分布在胞浆中。Pontin在正常肾组织或细胞中几乎不表达。3.肾癌患者中强阳性的Pontin胞浆染色显著与临床分期(P=0.003)、细胞核组织学分级(P=0.025)和远处转移(P=0.010)相关。4. Kaplan-Meier生存曲线与单因素cox回归模型生存分析结果一致,强阳性的Pontin胞浆染色显著与不良的预后相关。多因素cox回归模型分析示强阳性的Pontin胞浆染色可独立判断ccRCC患者的预后(HR：1.124-6.337,P=0.026)。5.细胞划痕实验与细胞侵袭实验示两条siRNA介导的Pontin降表达显著降低了肾癌细胞A498、786-0和KRC/Y的迁移能力(P0.0001)和侵袭能力(P0.001)。6.荧光细胞免疫组化结果示Pontin表达降低导致了胞核中β-catenin表达显著下调；实时定量RT-PCR结果示β-catenin的经典靶基因c-myc和cyclin D1表达显著下调(P0.05)。7.在20对冰冻ccRCC临床标本中实时定量RT-PCR不MICA在ccRCC中的表达量显著高于正常肾组织(P0.0001)。8.IHC示MICA在95.8%ccRCC组织中表达阳性。MICA在表达强阳性的组织中分布于细胞膜和呈颗粒状分布于细胞浆,然而在弱表达的组织中主要分布于细胞膜。相反,在正常肾组织中,MICA几乎探测不到。9. MICA表达水平与淋巴结转移(P0.001)和临床分期(P=0.003)显著相关,10.多因素cox回归模型分析示MICA表达水平可独立判断ccRCC患者肿瘤特异性生存率(HR：1.023-9.216,P=0.045)。11. GSEA结果示在EMT基因簇在TCGA ccRCC MICA高表达组中富集(enrichment score=1.7395, nominal P value=0.0166);实时定量RT-PCR示EMT间皮标志物Snail在MICA高表达组的表达水平显著高于MICA低表达组的表达水平(P=0.0476)。研究结论1. Pontin在ccRCC中的表达量显著高于正常肾组织,其在肾癌细胞胞核和胞浆中均有表达；胞浆Pontin表达与进展性肾癌相关。2.胞浆Pontin表达可作为ccRCC的预后标志物。3. Pontin高表达激活EMT通路,下调E-cadherin进而增加β-catenin的胞核定位是Pontin促进肾癌细胞侵袭迁移的潜在机制；Pontin有潜质作为肾癌治疗的新靶点。4. MICA在ccRCC中的表达量显著高于正常肾组织；其表达方式随表达水平升高而不同,在表达强阳性的组织中分布于细胞膜或呈颗粒状分布于细胞浆,而在弱表达的组织中则主要分布于细胞膜。胞浆表达的MICA可能参与了肿瘤细胞的免疫逃逸机制。5. MICA表达水平与进展性肾癌相关,可作为ccRCC的预后标志物。6. MICA在肾癌中的作用可能与EMT通路激活有关,需要进一步实验研究。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.25;R737.11
，

本文编号：1756037