eIF3e在结肠肿瘤中的相关性研究

发布时间：2018-04-16 18:15

本文选题：结肠 + 临床病理特征　；参考：《山东大学》2015年博士论文

【摘要】：研究背景恶性肿瘤作为世界范围内最大的致死性疾病,严重危害人类生命健康,人类的任何部位均可能受到肿瘤的侵袭。目前已发现100多种人类恶性肿瘤,就全世界而言,造成男性死亡的五种最常见恶性肿瘤依次为肺癌、胃癌、肝癌、结肠直癌和食管癌；而女性最常见恶性肿瘤依次为乳腺癌、肺癌、胃癌、结直肠癌和宫颈癌。随着生活习惯和饮食结构的改变,以及人口老龄化进程的加快,我国结直肠癌(Colorectal cancer, CRC)发病率及死亡率均在男、女恶性肿瘤中分别排名第5位和第3位,近几年发病率呈上升趋势,并且年轻化。结肠癌是的发生是一个复杂的多步骤过程,在这个过程中遗传和表观遗传畸变积聚导致正常结肠细胞向癌细胞的恶性转化。某些突变,像微卫星不稳,BRAF突变,18q的杂合性丢失,KRAS, p53,鸟苷酸环化酶2,ERCC-1等,在结肠癌中已被验证可以作为预测化疗耐药和预后的分子标记物。通过构建分析高通量的基因数据筛选在发病过程中的差异表达基因和信号通路,有助于我们了解结肠癌的发病机制。这些差异表达基因可以作为诊断和治疗结肠癌的新的生物标志物。在之前的研究中,我们已经获得了一个纯种系的人结肠癌细胞和正常结肠细胞,并且比较了这两种细胞的基因表达的差异,这种比较是通过结合cDNA微序列和反RNA的基因表达的长序列分析。在这两种细胞中差异表达的一些基因(如IFITM3 FERMT1、MT1F IMP3, PER3等)被认为是潜在结肠癌相关基因而作为进一步研究的目标。通过微阵列数据(信号：394.8和124.9)和基因表达的长序列分析(标记数：49比14),我们发现与正常结肠细胞相比,在结肠癌细胞中的真核翻译起始因子3组件E(eIF3e)是高表达的。研究目的：真核生物的蛋白翻译起始是一个复杂的细胞活动进程,它需要一系列的蛋白参与,这些蛋白就被称为真核翻译起始因子(eukaryotic initiationfactor,简称为eIF)。与原核起始因子相比,真核起始因子种类多且复杂,已明确的真核起始因子共有12种。通过这些真核起始因子之间以及不同的真核起始因子与核糖体、mRNA和起始tRNA之间的相互作用,来完成真核生物的翻译起始。因此,相比于原核生物,真核生物的翻译起始过程更多得依赖于蛋白质与蛋白质以及蛋白质与RNA之间的相互作用,而非RNA与RNA间的相互作用。除了参与真核翻译起始进程之外,许多真核起始因子还具有其他一些功能。大多数mRNA的翻译都是在限速步骤的开始被控制,导致由40S和60S亚单元组装成一个具有伸长能力的80S核糖体。首先,43S核糖体前起始复合物必须形成：这包括一个40S的小核糖体亚单元,起始甲硫氨酰tRNA(Met-tRNA)和一组真核起始因子(eIFs),包括eIF2。接下来,43S核糖体复合物被招募到mRNA的5’末端,用倒置的m7GpppN冒作为标志。这个43S的核糖体复合物和帽之间的关系是由帽结合(起始)复合体eIF4F来协调的。跟eIF4F相关,并且也参与启始的还有几个其他的起始因子,包括多亚单元复合物eIF3, mRNA结合蛋白如如多聚核苷酸尾结合蛋白(PABP;也称为PABPC1)。哺乳动物的eIF3复合物的由10-13蛋白质组成,这些蛋白参与了43S前起始复合物和eIF4结合mRNA之间桥接作用。由于eIF3在蛋白质中的关键作用及多种功能导致了它在肿瘤中许多有时甚至是相反的作用,而这可以通过它的亚单元的作用来加以区分。其中的几个亚单元形成一个核心复合物,被认为是蛋白质合成必不可少的,尽管其他亚单元也可能参与eIF3复合物的功能调节或者促进其与特定的mRNAs相互作用。EIF3e是真核翻译起始因子3(eIF-3)复合物的一个组成部分,这是一个在哺乳动物细胞蛋白质合成起始中具有至关重要的因素。翻译控制在癌症发生和发展的复杂机制中扮演关键角色。然而,eIF3e在结肠癌中的临床意义还有待阐明。为了研究eIF3在结肠癌中的作用,我们特设计了该试验。研究方法：我们选取了自2001年1月至2003年12月在上海交通大学附属第一人民医院实施结肠切除术的结肠癌病人共173例,留取了结肠癌组织标本和周围正常组织标本,这些患者手术前均未接受辅助化疗。福尔马林固定石蜡包埋组织标本采用组织学和免疫组织化学分析。所有样本由两位对临床信息单盲的病理学家进行分析和诊断。肿瘤的分期是根据美国癌症联合委员会(AJCC)分类系统,该系统分类是基于肿瘤大小(T),淋巴结转移与(N)和远处转移(M)。无病生存期(DFS)被定义为从手术至临床或放射检查证明复发或转移,而总生存期(0S)被定义为从最初的手术至死亡的时间间隔。随访是根据美国国家综合癌症网络实践指南,截止日期是2008年6月29日。x2检验或Fisher精确检验被用来评估eIF3e表达和临床病理特征之间的差异是否具有统计学意义。Kaplan-Meier方法用于分析病人的累积生存率。此外,单变量和多变量Cox比例风险模型被用于评估变量的风险比率。实验组之间的差异采用t检验或单向方差分析(ANOVA)进行了分析,随后又进行了方差分析。我们使用统计软件SPSS19.0(美国芝加哥,IL)进行统计分析。P0.05被认为是具有统计学意义。结果：生物信息学的结果：通过对两个转录组数据库的生物信息学分析发现,六个eIF亚单位都有明显的过度表达。这些基因都存在表达上调,包括eIF3e(P0.001)。在这些亚单元中,eIF3B、eIF3I eIF4E和eIF5A被证实与肿瘤进展有关。eIF3e在结肠癌进展中的作用迫切需要被阐明。eIF3e在结肠癌组织的异常高表达实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)表明,肿瘤组织中eIF3e在mRNA水平存在高表达。四十个肿瘤组织中有三十五个eIF3e mRNA表达较正常组织高。eIF3e mRNA表达的定量是3.04±2.65,肿瘤组织中eIF3e mRNA的表达与配对的正常组织相比有显著性(P0.01)。在TMA中分别含有癌组织和对照的正常结肠组织以及转移的淋巴结组织,为了检测eIF3d的表达,在这些组织中进行了免疫组化实验。EIF3e主要表达在结肠癌细胞的细胞质,结肠上皮细胞和间充质细胞中被观察到褐变(Figure 2)。正常粘膜和癌组织之间的差异(P0.001),以及正常粘膜和转移的淋巴结组织之间的差异(P0.001)均被发现具有显著性。在173例正常结肠组织中有6例中存在eIF3e存在高表达(3.5%),与之对比的是,在173例癌组织中有42例存在高表达(24.3%),在54例转移淋巴组织中中有31例(57.4%)存在高表达。结肠癌eIF3e表达与临床病理特征的关系：我们发现eIF3e表达与年龄、性别、肿瘤位置之间没有显著差异(P0.05)。相反,eIF3e表达与T分类相关(P0.001),淋巴结转移(P0.001),远处转移(P0.001),临床分期(P0.001),分化(P0.001),血管侵袭(P=0.036)都明显相关。这些数据强烈表明,eIF3e表达在结肠癌的发展起着重要的作用。eIF3e表达与结肠癌患者的预后价值Kaplan-Meier曲线分析表明患者高eIF3e表达预后较差。eIF3e的表达为阴性、弱阳性和强阳性的病人的总的生存期分别是86.5个月、72.67个月和37.1个月。通过对无瘤生存期的分析,也发现了相似的结果(84.33个月、66.69个月和29.14个月)。为了进一步研究结肠癌患者中eIF3e表达与预后的关系,我们设计了临床病理学特征与eIF3e表达水平之间的单变量分析。在单变量分析中,研究淋巴结转移,远处转移,临床分期,组织病理学等级,血管侵袭与无瘤生存期和总生存期的相关性。对单变量分析中的重要变量采用Cox比例风险模型分析进行多变量分析。N期和M期的被排除在多变量分析之外,因为他们与美国癌症连合委员会分期的共线性。高eIF3e表达预示着显著降低的生存率和疾病的高复发率。与eIF3e阴性表达相比,eIF3e高表达组发生疾病复发的风险要高10.3倍。同时,该组患者的生存期要低17倍。在体外实验中,下调eIF3e可以抑制结肠癌细胞增殖,克隆形成并促进细胞凋亡。结论：通过LCM-LongSAGE进行的基因表达谱研究表明,6个eIF亚单元(eIF2G, eIF3B eIF3E, eIF3I, eIF4E和eIF5A)在结肠癌细胞明显过度表达。过去的几年里,eIF4E在细胞转化,肿瘤发生和转移中的重要作用已经被证明。EIF-4E在多种人类肿瘤都过度表达,并已被视为治疗目标和作为人类研究癌症进展的标志。减少EIF3B基因的表达导致可以抑制人类结肠癌细胞的增殖。过度表达的eIF3I可导致结肠癌的转化,它的机制是直接上调环氧酶2(cox-2)蛋白的合成和激活β连环蛋白信号通路。EIF5A mRNA的表达水平是结直肠癌患者预后的一个重要因素。eIF2G在癌症中的功能和临床意义还尚未报道。我们可以推断,eIF亚单元的异常表达是结肠癌进展中的重要分子事件。通过调节eIF3的亚单元的活动可以改变蛋白质合成率。适当水平的转译起始因子对调节增殖和细胞周期是必需的,并且对致癌基因的转化也有重要作用。肿瘤发生在不同的组织类型通常与各种eIF3亚单元的不同的表达相关。eIF3e在我们的表达型数据库属于上调基因,但是它的表达和功能在结肠癌尚未表现出明确的特征。在最新的研究中,通过免疫组织化学染色证实了在结肠腺癌组织中elF3e在蛋白水平的高表达。eIF3e蛋白的过度表达与结肠癌患者较差的的总生存期和无病生存期显著相关。降低eIF3e可以抑制结肠癌细胞增殖,并促进细胞凋亡。作为eIF3翻译起始因子的一个组成部分,由于eIF3e的异常表达而引起的蛋白质合成的模式变化在致癌基因中的作用需要被阐明。最近,一个微阵列分析显示,在人乳腺癌细胞中,由eIF3e引起的mRNAs的正负调节在那些与细胞增殖,侵袭和凋亡明显相关的基因中明显增加。此外,通过应用eIF3e的特异性抗体进行RNA免疫印迹进而进行RT-PCR分析,结果表明,在MDA-MB-231细胞中进行下调eIF3e后,有丝分裂检查点复合物MAD2L1明显增多,而与凋亡相关的BCLXL的mRNA明显减少。最后,在体外实验中在敲除了eIF3e表达的乳腺癌细胞中表现出侵袭和增殖能力的明显降低。这些数据表明,eIF3e在乳腺癌进展具有癌基因的作用。结肠癌细胞中受eIF3e调控的靶基因应该在下一步研究被筛选和验证。一些研究已经在探讨eIF3e在肿瘤发生中的潜在机制。EIF3e被确认为是通过基因和化学基因通路调节MEK-ERK信号通路的一个组织特定性调节器。在eIF3e-siRNA转染细胞中MEK蛋白质水平降低。MEK是双特异性激酶,在这个通路中起到关键作用；它是Ras和Raf的下游靶基因,通过对酪氨酸和苏氨酸关键残基的磷酸化进而激活ERK1/2。MEK-ERK通路的异常调节可能导致细胞生长失控,最终导致恶性转变。针对MEK-ERK通路的小分子是潜在的治疗癌症的方法。一项研究表明,抑制eIF3e可以影响多种恶性胶质瘤(GBM)细胞的增殖、细胞周期和凋亡。当eIF3e不表达时,这些表型是独立于整个细胞的翻译起始的,并且伴随着HIF的表达减少。进一步研究的目的应该是明确eIF3e在结肠癌进展中的精确作用,为将来eIF3e在结肠癌患者的诊断和治疗中提供重要价值。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.35

【参考文献】