DEC2在胃癌中的作用及分子机制研究

发布时间：2018-04-17 00:20

本文选题：DEC2 + 胃癌　；参考：《山东大学》2017年博士论文

【摘要】：研究背景胃癌是我国常见的消化道恶性肿瘤,侵袭转移是恶性肿瘤生物学行为的具体反映,研究胃癌侵袭转移的精细调控机制,寻找、发现、和鉴定这个过程中的关键调控分子,对临床肿瘤的预防与治疗具有迫切的现实意义。多种转录因子和信号转导蛋白的激活以及肿瘤相关基因的差异表达,均可影响肿瘤的恶性进程,其中,转录因子对下游基因的表达调控作用是肿瘤发生发展的关键。探索转录因子在肿瘤中的具体表达调控模式,可为肿瘤生物治疗提供新的干预靶点和预测指标。转录因子DEC2是一个生长发育基因,具有碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)结构,之前DEC2的功能研究多集中在DEC2对生物节律、生长发育及免疫应答的调节中,最近报道了 DEC2以组织细胞特异性的方式参与调控肿瘤细胞恶性进程,研究发现,DEC2在胰腺癌肿瘤组织中表达低于癌旁正常组织,而在子宫内膜癌组织中表达高于癌旁正常组织。DEC2发挥作用主要体现在增殖凋亡调控和肿瘤细胞上皮间质转化调控。一方面,DEC2对肿瘤细胞增殖凋亡具有双重调节作用:DEC2通过下调cyclin D1表达抑制乳腺癌细胞增殖;另一篇关于乳腺癌的研究报道称,利用siRNA沉默乳腺癌细胞MCF-7中DEC2基因表达后,凋亡细胞数明显增加,进一步实验发现DEC2可调控Caspase8、Fas等基因的表达,通过死亡受体途径发挥抗凋亡效应;另外,在口腔癌细胞HSC-3中,DEC2通过抑制促凋亡因子Bim的表达发挥抗凋亡效应。另一方面,DEC2对肿瘤细胞侵袭转移具有双重调节作用:在乳腺癌中,DEC2结合到缺氧诱导因子(HIFs)启动子上抑制其表达,从而抑制肿瘤细胞转移;另外,通过与SP1竞争性结合TWIST1启动子区的SP1结合位点,DEC2可抑制子宫内膜癌发生EMT相关的肿瘤转移;在胰腺癌细胞BxPC-3中,DEC2通过调控SLUG抑制TGF-β 1诱导的EMT过程;关于头颈癌一项研究称,DEC2参与唤醒骨髓中的沉睡播散肿瘤细胞(DTCs)发生多器官转移。综上我们发现,DEC2在肿瘤细胞中发挥促癌或抑癌作用尚无定论。深入研究DEC2在胃癌恶性进程中的作用及分子机制是本研究拟解决的关键问题。研究目的为明确DEC2在胃癌恶性进程中的作用,我们通过免疫组织化学染色法检测胃癌组织和癌旁正常胃组织样品中DEC2的表达,并分析胃癌组织中DEC2表达水平与临床病理参数及病人生存预后的相关性,探讨其潜在的临床价值;然后通过质粒转染和慢病毒感染技术,获得过表达或干扰DEC2的胃癌细胞株,检测DEC2对胃癌细胞增殖、凋亡和侵袭转移等恶性生物学行为的影响;并进行下游基因和分子通路的筛选验证,进一步揭示DEC2发挥肿瘤调控作用的分子机制,为探索DEC2可否作为胃癌治疗的新靶点提供初步理论基础。研究方法1.免疫组织化学染色法检测DEC2在胃癌组织及癌旁正常胃组织中的表达水平,依据免疫组化染色评分标准,统计分析组织样本中DEC2表达水平与胃癌患者临床病例参数之间的关系及其与E-cadherin表达的相关性;收集胃癌患者的预后随访资料,采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,应用Log-rank检验统计DEC2和E-cadherin的表达水平与胃癌患者生存期之间的关系。2.qPCR 和 Western blot 法检测 DEC2 在胃癌细胞株(HGC27、MGC803、BGC823、MKN-45)及永生化胃上皮细胞株(GES-1)中的表达水平,同时筛选出高表达和低表达DEC2的胃癌细胞株。选择低表达DEC2的胃癌细胞株MGC803和MKN-45,通过慢病毒感染建立稳定过表达DEC2的细胞株;选择相对高表达DEC2的胃癌细胞株HGC27,通过慢病毒感染建立稳定干扰DEC2的细胞株。3.CCK8和EdU实验检测DEC2对胃癌细胞增殖能力的影响;Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测DEC2对胃癌细胞凋亡能力的影响;划痕和Transwell侵袭和迁移实验检测DEC2对胃癌细胞侵袭迁移能力的影响。4.选择SPF级BALB/cNude裸鼠,分别采用皮下注射和经尾静脉注射两种方式,将稳定过表达DEC2的胃癌细胞株DEC2/MKN-45、稳定干扰DEC2的胃癌细胞株DEC2-sh/HGC27及各对照组胃癌细胞株注入裸鼠体内。观察DEC2对胃癌细胞体内增殖和转移能力的影响。5.镜下观察DEC2对胃癌细胞形态的影响,Western blot和细胞免疫荧光染色法检测DEC2对上皮间质转化(EMT)指标蛋白(N-cadherin、Vimentin、E-cadherin)的调节作用。6.Western blot法检测DEC2对ERK/NF-κB通路相关靶蛋白表达水平的影响;通过加入ERK信号通路阻断剂,观察DEC2调节胃癌细胞上皮间质转化和细胞侵袭迁移能力的变化。研究结果1.DEC2在胃癌组织中低表达且与胃癌患者不良预后相关DEC2在癌旁正常组织和胃癌组织中的阳性表达率分别为67.35%和22.45%(p0.05),并且DEC2的表达与肿瘤浸润(p=0.001)、淋巴管转移(p=0.033)及TNM分期(p=0.001)呈显著负相关;DEC2在胃癌组织中的表达与E-cadherin的表达正相关(r=0.563,p0.001);高表达DEC2和E-cadherin组患者五年生存期显著高于低表达 DEC2 和 E-cadherin 组(p=0.003)。2.DEC2抑制胃癌细胞体外增殖及侵袭迁移qPCR和Western blot法检测结果显示,DEC2在永生化胃上皮细胞株GES-1中的表达水平显著高于胃癌细胞株(HGC27、MGC803、BGC823、MKN-45)。DEC2本底表达量最低的胃癌细胞株MGC803和MKN-45过表达DEC2后,其增殖和侵袭迁移能力明显受到抑制,而凋亡细胞比例增加;DEC2本底表达量相对较高的胃癌细胞株HGC27干扰DEC2表达后,其增殖和侵袭迁移能力明显增强,而凋亡细胞比例减少。3.DEC2抑制胃癌细胞体内成瘤及转移裸鼠皮下成瘤模型发现DEC2显著抑制胃癌细胞成瘤及瘤体生长:过表达DEC2后,肿瘤生长速度明显慢于对照组,瘤重小于对照组;干扰DEC2表达后,肿瘤生长速度明显快于对照组,瘤重大于对照组。裸鼠经尾静脉注射转移模型发现DEC2抑制胃癌细胞体内转移:造模6周后取裸鼠肺组织,计数其表面肿瘤转移灶,HE染色后观察其病理形态。结果显示,过表达DEC2组裸鼠肺组织转移灶明显少于对照组;干扰DEC2组裸鼠肺组织转移灶明显多于对照组。4.DEC2抑制胃癌细胞上皮间质转化(EMT)镜下观察发现,过表达DEC2后,胃癌细胞株DEC2/MGC803和DEC2/MKN-45形态趋于卵石状;然而,干扰DEC2表达后,胃癌细胞株DEC2-sh/HGC27形态无明显变化。Western blot和细胞免疫荧光染色法检测结果显示:过表达DEC2后,DEC2/MGC803和DEC2/MKN-45细胞间质标志物N-cadherin和Vimentin的表达水平明显减低,而上皮标志物E-cadherin的表达水平明显升高;干扰DEC2表达后,DEC2-sh/HGC27细胞间质标志物N-cadherin和Vimentin的表达水平明显升高,而上皮标志物E-cadherin的表达水平明显降低。5.DEC2通过阻断ERK/NF-κB通路抑制胃癌细胞发生EMT相关的侵袭转移Western blot检测结果显示:过表达DEC2后,DEC2/MGC803和DEC2/MKN-45细胞中ERK和NF-κB p65的磷酸化水平明显降低,而E-cadherin的表达水平明显升高;干扰DEC2表达后,DEC2-sh/HGC27细胞中ERK和NF-κB p65的磷酸化水平明显升高,而E-cadherin的表达水平降低。加入ERK通路抑制剂 U0126 后,在胃癌细胞株 DEC2/MGC803、DEC2/MKN-45 中,NF-κBp65的磷酸化水平以及其侵袭迁移能力进一步受到抑制,而E-cadherin的表达水平进一步升高。而在DEC2-sh/HGC27细胞中,U0126部分抵消了下调DEC2引起的NF-κB p65的磷酸化水平、侵袭迁移能力的升高和E-cadherin的表达水平的降低。研究结论1.首次发现DEC2在胃癌组织中低表达且与胃癌患者不良预后相关。2.体内体外实验证实DEC2可抑制胃癌细胞增殖、侵袭迁移、上皮间质转化(EMT)等多种恶性生物学行为。3.DEC2通过阻断胃癌细胞中ERK/NF-κB信号通路上调E-cadherin表达,进而调控胃癌细胞上皮间质转化(EMT),最终抑制胃癌转移。
[Abstract]:On the other hand , DEC2 has a double regulatory effect on tumor cell proliferation . In addition , DEC2 plays an important role in the regulation of tumor cell proliferation by downregulating the expression of apoptosis factor Bim . In addition , DEC2 plays a dual role in regulating tumor cell proliferation . In addition , DEC2 plays an important role in inhibiting tumor cell proliferation . The effects of DEC2 on gastric cancer cell proliferation , proliferation , apoptosis and invasion and metastasis of gastric cancer cells were determined by means of plasmid transfection and slow virus infection . The expression level of DEC2 in gastric epithelial cell line GES - 1 was significantly higher than that in gastric cancer cell line ( HGC27 , MGC803 , BGC823 , MKN - 45 ) . The proliferation and invasion and migration ability of gastric cancer cell lines MGC803 and MKN - 45 were significantly inhibited after DEC2 expression . The expression levels of ERK and NF - 魏B p65 in DEC2 / MGC803 and DEC2 / MKN - 45 cells were significantly lower than those in control group . 3 . DEC2 regulates the expression of E - cadherin by blocking ERK / NF - 魏B signaling pathway in gastric cancer cells , thus regulating the epithelial mesenchymal transition ( EMT ) of gastric cancer cells , and finally inhibiting gastric cancer metastasis .

【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.2

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