miR-30C介导的GAGE12I信号通路促进胃癌转移和增殖的研究

发布时间：2018-04-17 05:11

本文选题：GAGE12I + 胃癌　；参考：《山东大学》2017年博士论文

【摘要】：背景:胃癌是一种严重危害人类健康的恶性肿瘤,其造成患者死亡人数居所有恶性肿瘤致死人数的第二位。胃癌一旦发生便以较快的速度进展,较易发生远处转移,手术切除胃癌组织是目前相对有效的治疗方式。但由于胃癌细胞的高浸润性和高转移性,对于中晚期胃癌患者而言手术疗效并不令人满意。因此,在基因水平上进一步阐明胃癌转移的分子机制,有助于胃癌的治疗及预后水平的提高。本研究通过基因芯片技术,相对于非转移性的胃癌组织在转移性的胃癌组织中中筛选出数百个差异表达基因。进一步分析显示在26个表达差异最为明显的基因中包括了 GAGE家族中的GAGE12I及GAGE12D等成员。GAGE基因家族可在肿瘤组织和正常睾丸组织中表达,而在其它正常组织中不表达。有报道显示GAGE基因表达的蛋白产物能够引起免疫系统的反应,因此其表达的产物又被称为肿瘤-睾丸抗原。有研究显示GAGE基因与肿瘤患者较差的临床预后相关,而包括CAGE12I等家族成员在胃癌中的生物学调节作用尚不清楚。本研究的前期实验提示GAGE12I等家族成员在转移性的胃癌组织中的表达显著上调,提示其可能与胃癌的进展特别是与胃癌的转移相关。GAGE12I对胃癌细胞的浸润、转移以及增殖的调节作用值得进一步研究。GAGE12I在胃癌中的表达模式能否成为胃癌患者的生物学标记物,以及其异常表达的上游调节机制均需要进一步探讨。mircoRNAs是一类短链且非编码RNA,它们通过碱基互补的作用方式结合在靶基因的3'-UTR区域,在转录后的水平抑制靶基因的蛋白表达。在本研究中,通过软件预测发现GAGE12I 可能受到 miR-30C(miR-30C-1-3P 和 miR-30C-2-3P),miR-887-5p,miR-320b以及miR-590-3p等多个miRNAs的负向调控。这些miRNAs是否真正发挥对GAGE12I的调节作用,以及其是否通过负向调控GAGE12I发挥调节胃癌进展也值得深入研究。方法:1.mRNA基因芯片在胃癌组织中检测转移相关的差异表达基因。收集原发的胃癌新鲜标本,其中未发生淋巴结转移的非转移性胃癌组织及伴有淋巴结转移的转移性胃癌组织各5例,进行mRNA芯片检测。对转移性胃癌和非转移性胃癌中的基因表达进行对比,按照基因在转移组中表达上调比值(?)2.0或下调比值≤0.5,并且满足P≤0.05进行差异基因的初步筛选。2.RT-qPCR检测基因mRNA及miRNA的表达。将收集的胃癌新鲜组织或是胃癌细胞样本,提取总RNA并逆转录成cDNA。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测各样本中基因表达情况。对miRNA的检测,首先使用miRNA提取试剂盒提取石蜡组织中的miRNA,再进行逆转录及RT-qPCR检测。3.目的基因蛋白表达的检查。收集132例胃癌石蜡标本,免疫组织化学(IHC)技术检测目的蛋白在胃癌组织中的表达情况。在胃癌细胞中转染GAGE12I过表达载体或miR-30C后,Western-blot检测相关目的蛋白相对于对照组的表达情况。4.Transwell检测胃癌细胞迁移和浸润能力。将GAGE12I过表达载体或miRNAs mimics及相应的对照载体或mimics转染胃癌细胞系,进行Transwell实验检测胃癌细胞的迁移和浸润能力的改变。5.细胞增殖和凋亡检测。将GAGE1 21过表达载体或miRNA mimics及相应对照转染胃癌细胞,通过MTS、EDU及流式细胞学实验检测胃癌细胞的增殖和凋亡能力的改变。6.动物学实验。以慢病毒感染的方式在胃癌细胞系中稳定过表达GAGE12I。再将感染后的胃癌细胞通过皮下和尾静脉注射的方式注入裸鼠体内。5周后与对照组相比,观察裸鼠皮下成瘤情况和远处脏器转移的情况。分析GAGE12I对胃癌细胞的浸润、转移以及增殖情况的影响。7.mRNA表达谱芯片分析受GAGE12I调控的信号通路。收集过表达GAGE12I及对照组胃癌细胞,进行mRNA基因表达谱检测。分析差异性表达的信号通路,并结合信号通路的功能筛选可能受GAGE12I调控的信号通路。并以RT-qPCR和western-blot实验验证受调控的信号通路。8.ELISA实验检测VEGF的表达。收集过表达GAGE12I组及对照组的胃癌细胞培养上清液,按照试剂盒的说明进行ELISA试验操作,检测GAGE12I对细胞外泌VEGF表达的影响。9.miRNA的预测与验证。首先通过软件对可能结合在GAGE12I-3'UTR区域的miRNA进行预测。通过构建GAGE12I-3'UTR双荧光素酶载体,双荧光素酶实验验证miRNA对GAGE12I表达的调控作用。再进行western-blot实验进一步验证miRNA对GAGE12I蛋白表达水平的调控,从而最终确定能够直接调节GAGE 121 的 miRNA。10.数据分析。两组数据之间的差异采用Student t-test的检验方法。Kaplan-Meier和Log-rank检验法分析GAGE12I以及miR-30C的表达与胃癌患者术后生存的关系。GAGE12I与miR-30C之间的关系采用Spearman' s相关分析。P0.05有统计学意义。结果:1.基因芯片结果显示GAGE12I等GAGE基因家族成员的表达在转移性胃癌组织中显著上调。基因芯片结果显示在转移性的胃癌组中发现700个显著下调的基因和450个显著上调的基因。在差异最显著的26个基因中发现了GAGE121及GAGE12D等GAGE家族的基因。2.实验结果进一步证实GAGE12I及GAGE12D在转移性胃癌组织中表达上调。在扩大样本量的胃癌新鲜组织样本中进行RT-qPCR验证,结果显示GAGE12I及GAGE12D在转移性胃癌组织样本中的表达显著升高,该结果与基因芯片的结果一致。IHC结果显示GAGE12I蛋白主要在胃癌细胞的胞核中表达,并且再次证实其在转移性的胃癌组中明显上调。3.GAGE12I促进胃癌细胞的迁移和浸润。体外实验结果显示:BGC823,AGS及MKN45细胞的迁移与浸润能力在过表达GAGE12I后明显增加。动物学实验结果显示GAGE12I在动物体内明显促进癌细胞的局部浸润与远处转移能力。4.GAGE12I在动物体内促进胃癌细胞的增殖。体外实验结果显示:GAGE12I在体外对胃癌细胞的增殖或凋亡能力没有明显的影响。然而,动物学实验显示过表达GAGE12I后胃癌细胞的增殖能力明显增加,肿瘤的生长速度加快,即GAGE12I在动物体内明显增加胃癌细胞增殖能力。5.GAGE12I上调VEGF信号通路活性。基因芯片结果显示在胃癌细胞内过表达GAGE12I能够明显上调VEGF信号通路的表达。后续通过RT-qPCR及western-blot等实验也表明GAGE12I能够明显上调VEGF信号通路的表达,相关基因如VEGF,Paxillin,P38,pHSP27等表达明显上调。6.Snail及E-cad等EMT相关基因的表达也受GAGE12I的显著调控。RT-qPCR及western-blot实验结果表明GAGE12I在胃癌细胞中显著上调Snail的表达和下调E-cad的表达。7.GAGE12I通过上调VEGF促进胃癌血管新生。ELISA实验显示GAGE12I能够促进胃癌细胞外泌的VEGF增加,EDU实验显示以GAGE12I组胃癌细胞上清液培养人内皮细胞HUVEC后,其增殖能力明显增加。动物学实验显示GAGE12I组的皮下瘤体中CD34阳性(CD34+)的微血管数量明显高于对照组。在人胃癌组织中,GAGE12I高表达组中CD34+微血管数也明显多于GAGE12I低表达组中CD34+微血管数。8.GAGE12I受miR-30C的负向调控。软件预测可能对GAGE12I具有负向调控作用的miRNAs,结合miRNAs相关功能研究筛选出miR-30C-1-3P,miR-30C-2-3P,miR-887-5p,miR-320b 以及 miR-590-3p 等多个 miRNAs。双荧光素酶实验显示miR-30c-1-3p及miR-30c-2-3p能够明显抑制GAGE12I的表达;western-blot 进一步证实 GAGE12I 的表达能够受 miR-30c-1-3p 及 miR-30c-2-3p的负向调控。相关分析也显示miR-30c-1-3p及miR-30c-2-3p的表达均与GAGE12I的表达均呈现负相关关系。9.GAGE12I及miR-30C的表达与胃癌患者的生存预后密切相关。GAGE12I高表达预示着胃癌患者较差的总体生存率及无瘤生存率,而miR-30c-1-3p及miR-30c-2-3p的高表达则预示着胃癌患者较高的总体生存率,miR-30c-1-3p高表达还预示着较高的无瘤生存率。10.miR-30c-1-3p及miR-30c-2-3p能够显著抑制胃癌细胞的迁移和浸润。Transwell实验结果显示在胃癌细胞中过表达miR-30c-1-3p及miR-30c-2-3p均能够显著抑制胃癌细胞的迁移浸润能力,但对胃癌细胞的增殖能力无明显影响。结论:1.GAGE12I及GAGE12D在转移性胃癌组织中高表达,并且GAGE12I的高表达预示胃癌患者较差的临床预后。2.GAGE12I能够在体内、外明显提高胃癌细胞的迁移、浸润以及转移能力。GAGE12I在体内还能够上调胃癌增殖和血管新生的能力。3.GAGE12I在胃癌细胞内通过调节VEGF信号通路活性及癌细胞EMT而促进胃癌的进展。4.GAGE12I的表达受miR-30c-1-3p及miR-30c-2-3p的负向调控,并且高表达的miR-30c-1-3p及miR-30c-2-3p预示胃癌患者较好的临床预后。5.miR-30c-1-3p及miR-30c-2-3p能够显著抑制胃癌细胞的迁移和浸润。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.2

【参考文献】