基于功能化石墨烯新型DNA生物传感器的构建及在肿瘤检测中的研究

发布时间：2018-04-17 23:27

  本文选题：功能化石墨烯 + DNA　； 参考：《重庆大学》2016年博士论文

【摘要】：随着工业化进程日益加快,环境污染日渐严重以及人口老龄化不断加速,恶性肿瘤的发病率和死亡率也在快速攀升,已然成为威胁人类健康的头号杀手。因为恶性肿瘤的早期患者所治愈的可能性远远大于晚期患者,而且要节省更多的财力、人力和时间,倘若肿瘤发生能够及时被检测,这对于提高肿瘤治愈率和延长患者生存期具有重要的临床意义。随着对基因结构和功能研究的不断深入,人们逐渐发现恶性肿瘤等重大疾病都与遗传基因有关。基因DNA分子的结构序列发生微小改变,都会导致遗传信息的改变或疾病的发生。通过对与肿瘤发生相关的基因序列检测,对肿瘤的早期诊断、监测和治疗方面具有重要临床应用价值。基于纳米技术、生物传感技术和电化学分析技术,本研究构建了一系列在肿瘤早期筛查和诊断中具有重要应用前景的高灵敏电化学DNA生物传感器。从功能化石墨烯纳米材料的制备,传感器敏感界面的构建以及新型信号增强的DNA传感器的研制,并研究新方法及其应用等方面进行了探索和研究,为恶性肿瘤的早期检测以及相关研究提供新的思路。本论文主要开展的工作及结果如下:(1)基于GO-COOH/Cu O NWs构建的DNA生物传感器对肺癌相关基因CYFRA21-1的检测制备羧基功能化石墨烯(GO-COOH)以改善r GO的分散性和生物相容性,再合成氧化铜纳米线(Cu O NWs),并充分结合二者的优势,通过简单的混合使其相互交织缠绕形成网状结构,这种方法避免了将两者进行复合的繁琐合成步骤,且复合物中的Cu O NWs充当电子传递“导线”,能够促进电极的电子传递速率。对所制备的GO-COOH/Cu O NWs复合材料进行SEM、TEM、EDX和FTIR表征和电化学性能测试。将5’端修饰有-NH2的CYFRA21-1探针分子通过酰胺共价固定到GO-COOH/Cu O NWs工作电极表面。采用MB做杂交指示剂,利用ss DNA/GO-COOH/Cu O NWs/PLLy/GCE构建的电化学DNA传感器对CYFRA21-1基因的人工合成序列进行检测。研究结果表明该传感器在1.0×10-6~1.0×10 12 mol/L的浓度范围内与电化学响应信号呈良好线性关系,以及良好的选择性和稳定性。(2)构建NG/Au NPs DNA生物传感器并检测HL-60人原髓白血病细胞的MDR1基因采用元素掺杂的方法进一步改善石墨烯的电化学活性。对GO进行N原子掺杂,再将Au3+原位还原到NG中,从而得到NG/Au NPs复合材料,再利用强烈的S-Au键将巯基修饰的MDR1基因探针固定在传感器NG/Au NPs修饰电极表面。利用SEM、TEM、XRD和XPS对材料的理化特性进行了表征。基于NG/Au NPs的优异的电催化能力和生物相容性,构建的电化学DNA传感器对MDR1基因人工合成序列的最低检出限为3.12×10-15 mol/L。构建的DNA生物传感器在肿瘤实际样品检测中进行了初步应用。利用构建的NG/Au NPs DNA生物传感器检测HL-60人原髓白血病细胞的MDR1基因的RT-PCR产物,并将实验结果与分子生物学中最常用的PCR法相比较,结果表明建立的NG/Au NPs电化学DNA传感器检测方法速度更快、灵敏度更高,在临床上实现对白血病多药耐药相关基因MDR1的检测方面具有良好的应用潜力。(3)基于3D NG/Fe3O4构建的新型DNA生物传感器研究在上一章的研究基础上,整合2D石墨烯制备具有三维(3D)泡沫结构的功能化石墨烯。采用环保绿色,操作简便的一步水热法自组装合成三维石墨烯-四氧化三铁水凝胶(3D NG-Fe3O4)材料,对其三维结构形成机理进行探讨。功能化的3D NG不仅保持了石墨烯固有的品质,而且在电催化反应和导电材料等方面具有相对二维(2D)石墨烯材料更优越的性能,比如高孔隙率、高活性比表面积、柔韧性以及更优异的导电性等。各种技术(SEM、TEM、EDX和XPS)被用来表征3D NG-Fe3O4的结构和组成,并在最优化实验条件下运用3D NG-Fe3O4修饰的生物传感器与目标DNA杂交反应并灵敏度分析。采用标准加样法研究了3D NG/Fe3O4修饰的生物传感器在白血病人血清环境中分析检测MDR1基因序列的能力,分别在TE buffer溶液,1%人血清,5%人血清中均具有良好的检测识别能力,抗干扰性较好。(4)3D GF/Ag NPs电化学DNA传感器的构建并用于非小细胞肺癌CYFRA21-1基因RT-PCR酶切产物的检测采用化学气相沉积法(CVD),以CH4为碳源,泡沫镍为三维模板和催化剂,制备结构更加立体和均匀的3D石墨烯材料,利用SEM、TEM、EDX及接触角检测对材料的理化特性进行表征。证明制备的3D GF是高品质、几乎无缺陷的。再利用电沉积法将银纳米颗粒(Ag NPs)复合到3D GF的三维立体碳骨架上,使完美的三维网格结构表面覆盖一层具有优异性能的Ag NPs并改善3D GF亲水性。通过考察电位扫描速度与ss DNA/3D GF/Ag NPs/GCE的电化学响应的关系,探讨其修饰电极表面的动力学机理,证明了3D GF/Ag NPs稳定立体的多孔贯通结构,不仅极大的增大电极的有效面积,也为ss DNA探针序列在电极表面的负载提供了有利条件,3D GF/Ag NPs是一个新颖的、有前途的电化学DNA传感器修饰材料。基于3D GF/Ag NPs构建的电化学DNA传感器对非小细胞肺癌基因CYFRA21-1实际样品的检测效果满意,证明该方法的准确性。(5)DNA标记的三明治型生物传感器对乳腺癌MCF-7细胞的检测研究制备一种三明治型免疫传感器用于电化学测定人乳腺癌MCF-7细胞的检测,并结合电化学生物传感器和DNA修饰抗体的优点。首先用3D GF作为理想的电极底层材料,再利用金纳米笼功能化MWCNT材料作为乳腺癌ER蛋白抗体(antibody-ER,Ab1)的吸附基底。利用UV、SEM、TEM及细胞毒性测试对材料的理化特性进行表征。Au NCs与MWCNT-NH2复合物具有低毒性、高活性比表面积、良好的生物兼容环境以及其新颖独特笼状结构,能够有效增强了电极表面的电子转移能力,且与Ab1抗体间发生高强度地形反应,增加了Ab1在电极表面的固载量,从而能够将更多的乳腺癌MCF-7细胞吸附在传感器上。利用偶联剂EDC+NHS的作用将ss DNA的5’端修饰乳腺癌ER蛋白抗体制备ss DNA-Ab2生物探针分子,这种方式既避免了抗体酶标记的过程,又具有较高的捕获效率。最后通过构建修饰有功能化纳米材料-抗体Ab1、乳腺癌MCF-7细胞和ss DNA-Ab2生物探针的三明治型仿生界面成功实现对乳腺癌MCF-7细胞的测定。该免疫传感器也具有较好重现性和稳定性,同也适用于其他相关的肿瘤标志物。这种构建方式为肿瘤细胞检测提供了一种有效的电化学检测手段,也为免疫传感器的构建打开了一种新思路。
[Abstract]:闅忕潃宸ヤ笟鍖栬繘绋嬫棩鐩婂姞蹇，

本文编号：1765791