ERCC1的mRNA表达与非小细胞肺癌患者铂类化疗预后的相关性研究

发布时间：2018-04-24 18:59

本文选题：ERCC1 + mRNA　；参考：《吉林大学》2015年博士论文

【摘要】：肺癌在全球范围内是致死率最高的恶性肿瘤（InternationalAgency for Research on Cancer, IARC， http://www.iarc.fr）。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌病理类型中最常见的肺癌，占所有肺癌病例70%以上（IARC，2008）。据世界卫生组织WHO最新调查，肺癌的年龄标准化发病率为33.5例／100，000人，在男性中为45.9例／100，000人，明显高于女性21.3例／100，000人。虽然传统外科等治疗手段的日益进步已经极大地改善了肺癌患者的预后及生存质量，但由于目前对肺癌发病的分子机制缺乏深入的认识，因此现有的早期诊断靶标及抗癌治疗对肺癌患者的作用也显得非常有限。据报道，在首次就诊的非小细胞肺癌患者中，超过50％的病例已进展为III期或已出现转移，失去手术治疗的机会。而最近，铂类为基础的联合化疗方案被认为是治疗晚期非小细胞肺癌最有效的方法之一。然而，肿瘤是高度异质性疾病，即便处于同样临床分期或病理类型相同的肺癌患者，对铂类化疗药物的敏感性往往呈显著差异。目前学界普遍认为非小细胞肺癌的基因型差异与机体对铂类为基础的化疗药物的敏感性具有一定的相关性。铂类化疗药物，如顺铂及卡铂是目前抗癌化疗药物中应用最为普及，疗效最为明确的抗癌药物之一，具有较强的细胞毒性。铂类药物进入细胞核后与核内DNA结合，通过形成铂-DNA络合物，导致DNA不可逆性损伤，并诱导细胞发生凋亡(apoptosis)，从而发挥其抗癌作用。由于细胞内存在DNA损伤修复机制，铂类化疗药物造成的DNA损伤部分可由细胞通过募集DNA损伤修复相关因子进行修复，因此DNA修复过程中调控因子的表达及其功能被认为在肿瘤对铂类化疗药物的敏感性起着重要的决定作用。这些分子的表达及其功能的异常激活，可以通过增强肿瘤细胞对铂类化疗药物的耐受性，影响铂类化疗药物在非小细胞肺癌患者中应用疗效。核苷酸切除修复机制（NER）是DNA修复途径中最为主要的途径之一，可以切除修复顺铂诱导及UV辐照产生的DNA损伤。目前人们已发现20余种参与NER修复途径的酶蛋白，可以特异性识别DNA损伤片段，通过协同作用共同完成DNA损伤修复过程。切除修复交叉互补基因1-ERCC1便是其中最为关键的限速酶，，与XPF共同负责催化基因5’端切口，NER途径中起着重要的作用。核糖核苷酸还原酶M1亚基基因（RRM1）在人类基因组中位于染色体11p15.5位点，其编码蛋白负责催化脱氧核糖核苷酸的生物合成，在DNA合成中起着重要的调控作用。以往的研究表明，ERCC1和RRM1在非小细胞肺癌患者中与铂类抗癌化疗药物的敏感性密切相关，并有可能影响非小细胞肺癌化疗后预后。Kotoula等人，2012; Leng等人，2012。但迄今为止，ERCC1与RRM1分别在非小细胞肺癌铂类抗癌治疗敏感性及其他临床相关指标的研究尚未见报道。尤其是ERCC1和RRM1两个基因之间的联系及其与非小细胞肺癌铂类化疗后的预后指标的相关性成为铂类化疗方案在非小细胞肺癌中应用的关键问题。为了明确ERCC1和RRM1基因在非小细胞肺癌对铂类化疗药物敏感性的作用，在本课题中我们通过前瞻性临床研究，分析ERCC1及RRM1基因在297例中／晚期，接受铂类化疗方案NSCLC患者中的表达水平，与患者的临床指标进行临床相关性分析，探讨这两个基因在非小细胞肺癌在铂类化疗药物敏感性的相关性，系统评估ERCC1及RRM1基因作为预测铂类化疗药物对非小细胞肺癌患者应用后的疗效是否具有临床指导意义。本研究中，我们收集了2007年9月和2009年9月之间，323例就诊于吉林大学第二医院胸外科，局部晚期或出现转移无法接受手术切除的非小细胞肺癌（TNM分期：IIIB期和IV期NSCLC）患者血液组织标本。将入组条件设为：首次接受铂类化疗至少两个疗程的患者，纤维支气管镜或经皮穿刺取病理组织，经病理诊断后明确无法进行手术治疗的IIIB或IV期非小细胞肺癌，WHO体力状态（WHOperformance status）为0-2，并可直接检测肿瘤对铂类化疗药物反应的患者。临床辅助检查数据和影像学图片均来源于吉林大学第二医院胸外科病历纪录。非小细胞肺癌的病理学分类依据世界卫生组织标准（WHO，1981）进行分类。以下情况中出现任何一项的患者均排除在入组条件之外：继发性肺部肿瘤，出现妊娠，伴有严重心肺功能不全和严重营养不良等并发症的病人。所有患者（包括入组及未入组的患者）均签署了书面知情同意书。我们的研究方案经吉林大学第二医院的伦理委员会审核后获批准。入组的所有患者就诊后均接受了标准的铂类联合化疗方案。该方案包括：第1天接受75mg/m2的顺铂或卡铂，并在第1天和第8天接受1000mg/m2的吉西他滨；或者在第1天和第8天应用25mg/m2的长春瑞滨，或第1天给予175mg/m2紫杉醇。当接受铂类化疗的患者出现疾病突然恶化或患者无法承受化疗药物毒性时，铂类化疗即时终止。根据肿瘤对铂类联合化疗的反应，将患者分组为化疗药物高反应组及化疗药物低反应组。患者表现为经铂类化疗后呈完全缓解或出现部分缓解被定义为高反应，而患者经铂类化疗后肿瘤并无变化或反而恶性进展则被定义为低反应。我们主要借助在入组患者接受铂类化疗前后接受的胸部X线及胸部CT等影像学检查以明确肿瘤对铂类化疗药物的反应性。总体生存期为（OS）指从直至患者死亡或随访结束日期。本研究入组所有患者均需要提供5ml全血样本，血样采集完毕后标上患者信息与采血时间，并立即保存于－70o C超低温冰箱，直到试验开始。患者血样中总RNA的提取采用EZNA血液RNA小提试剂盒EZNA Blood RNA Mini Kit(Omega, Berkeley, CA, USA)，具体方法请见实验方法及实验记录本。将RNA通过反转录PCR逆转录为cDNA后，通过实时定量PCR（qRT－PCR）方法检测ERCC1和RRM1的mRNA表达水平。将actin蛋白设为内参，选取相对定量法进行计算。qRT－PCR反应体系为20μL:模板DNA含量为50ng，加入200μM的dNTP，2.5units Taq DNA聚合酶（Promega Corporation, Madison, WI, USA）以及200μM的引物。PCR程序设为：94℃预热2分钟，解链94C30秒，退火64C30秒，延伸72℃1分钟，终止反应4℃，反应循环数为35。为了增强实验组与对照组试验数据可靠性，避免人为的实验操作误差，我们抽取所有的病例和对照组病例中10％作为随机样本进行基因测试，结果表明我们的试验结果前后一致，可重复率为100％。数据采用SPSS16.0统计软件包处理，应用Excel作图，用F检验首先进行方差分析，以t检验判断差异显著性。连续变量以均数±标准差，分类变量则表示为频率和百分比。ERCC1和RRM1表达与化疗反应之间的相关性主要通过OR值（odd ratio）及95％可信区间（CI）来进行评估。ERCC1和RRM1表达与非小细胞肺癌的操作系统之间的关系由Cox回归模型的危险比（hazard ratio, HR）及其95％可信区间（CI）的评估。所有患者的OS时间绘制采用Kaplan-Meier生存曲线法。P 0.05视为具有统计学显著差异，所有的监测都是双向测试。所有的323例非小细胞肺癌病例中，297位患者同意参加本试验，参与率高达91.95％。总体患者的年龄中位数为61.5岁（34.6-74.1岁之间）。全体非小细胞肺癌患者中69.1％为男性，57.5％的患者处于TNM分期IV。病理学分型：非小细胞肺癌中的腺癌和鳞状细胞癌的分别占到56.7％和37.4％。54.5％的非小细胞肺癌患者经ECOG体能测试后，处于第1-2阶段。在随访期间，由于联系方式更迭，我们失去了5例患者的随访信息。所有患者均随访至2012年9月。在随访结束时，132人出现死亡，165例病情呈恶性进展。研究结束时，中位OS分别为18.7个月（1－60个月）。我们通过qRT－PCR方法检测ERCC1和RRM1mRNA的表达水平，β-actin蛋白设为内参，进行相对定量分析。ERCC1和RRM1的平均表达水平分别为2.46×10-2和0.97×10-2。我们通过与ERCC1和RRM1mRNA表达水平中位数比较，将患者群体分为高表达或低表达组。在所有297例病人中，146例患者表现出完全化疗后缓解，151例经过化疗后部分得到缓解。患者中ERCC1低表达的患者相对于高表达患者，对化疗呈高反应性，出现完全缓解的病例较多，在95％可信区间内OR值为1.56（1.03-2.47）。为了探讨ERCC1和RRM1的表达水平与患者生存期之间的相关性，我们通过Cox回归模型，分析患者ERCC1和RRM1的mRNA表达量与总体生存期OS之间的相关性。我们发现，ERCC1水平低的患者群体与其高表达患者群体相比，拥有更长的生存期：95％可信区间内标准化危险系数HR为0.57（0.35-0.93）。近年来，分子靶向药物的研发、靶向药物与化疗药物的联合使用、个体化治疗的发展，使某些肿瘤的治疗效果显著提高，肿瘤药物治疗取得阶段性的进展。尽管如此，分子靶向抗肿瘤药物也面临诸多的问题与挑战：疗效不确定、易产生耐药、毒副作用大、联合用药盲目等问题一直没有得到很好的解决。抗癌个体化治疗指根据癌症患者的特异性基因型，采用针对患者特异性遗传信息如预后分子标记物，制定最佳的治疗方案，对患者病程进行有效干预的治疗方法。我们的研究表明，ERCC1基因的表达水平可以提示非小细胞肺癌肿瘤细胞对铂类化疗的敏感性，其表达水平在预示患者接受铂类化疗的预后过程中呈独立因素。携带ERCC1低表达的患者群体与ERCC1高表达患者群体相比，其生存期显著延长。在小样本研究中已有人发现ERCC1低表达的患者群体与ERCC1高表达患者群体相比，对铂类化疗药物具有更高的敏感性。我们的研究结果与先前的研究结果一致。然而，亦有研究发现ERCC1的表达水平与患者的生存或治疗预后无明显相关性。我们分析：ERCC1的表达可能仅在晚期非小细胞肺癌预后具有临床指导意义。鉴于ERCC1在细胞NER途径中扮演者重要的角色，是NER途径的关键限速酶，而NER途径在恶性肿瘤对铂类化疗药物敏感性中起着重要作用，由此不难推测ERCC1基因的表达在不同人类恶性肿瘤对铂类化疗的反应过程中起到一定的调控作用。已有大量研究报道，在人类不同的恶性肿瘤中ERCC1参与肿瘤的铂类耐药机制中，这些恶性肿瘤包括胃癌，结直肠癌，膀胱癌以及非小细胞肺癌。Huang等人的研究报道称，ERCC1的表达是III期结直肠癌患者接受FOLFOX方案辅助化疗出现早期耐药现象的一个重要预测因子，而检测患者体内ERCC1的表达水平有助于医生根据其表达结果对病人采取不同的治疗方案，并从而提高结肠癌患者对化疗药物的反应，增强铂类化疗药物的杀伤性。Li等人曾就美国胃癌患者进行临床相关性研究，提出ERCC1和ERCC2功能性SNP位点可能影响胃癌患者的生存期。而在非小细胞肺癌中ERCC1的表达与非小细胞肺癌患者预后之间的相关性则尚有一定争议，在不同的研究中得出不一致的结论。Tantraworasin课题组在247例接受肺癌根治术的晚期非小细胞肺癌病人中进行了一项回顾性临床研究，发现ERCC1和RRM1的表达并不影响肿瘤复发和患者的总生存期。Ozdemir的等人的研究结果也提示，ERCC1的表达水平与患者的生存期或患者对治疗的反应并无显著的相关性。而在Vassalou等人在希腊的非小细胞肺癌患者中进行的一项研究表明，ERCC1可以很好的提示患者接受化学治疗后的预后，因而对个体化化疗治疗晚期非小细胞肺癌具有重要的临床指导意义。此外，最近的一项循证医学meta分析研究表明ERCC1基因低表达或不表达的患者与ERCC1高表达患者相比，其对治疗有更好的反应，生存期显著延长。由于缺乏单一变量，即研究对象存在种族，对照受试者的来源，样本大小以及偶发事件对临床相关性研究均起着一定的干扰作用，因此ERCC1在非小细胞肺癌患者的临床研究呈不同的结果。因此，如何克服干扰因素，全面系统深入研究ERCC1基因多态性与非小细胞肺癌患者预后之间的相关性，并在大临床样本中不断验证，成为目前肺癌领域函待解决的重要问题。与此同时，越来越多的研究通过免疫组化方法证实RRM1蛋白的表达水平可以在不同的人类恶性肿瘤中预示患者的预后，这些肿瘤包括乳腺癌，胰腺癌和胃癌等。已有研究表明RRM1基因在非小细胞肺癌患者的表达水平与患者的预后无明确的相关性。与早前的研究结果一致，在我们的研究中，我们发现RRM1表达水平在接受辅助化疗或未接受辅助化疗的晚期NSCLC患者中无显著的临床相关性。综上所述，我们的结果表明，ERCC1的mRNA低表达预示晚期非小细胞肺癌患者对铂类化疗方案具有更好的敏感性，提示患者接受铂类化疗后生存期延长。因此，我们提出ERCC1在mRNA水平的表达水平可作为制定非小细胞肺癌个体化治疗的重要参考指标。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2

【共引文献】