凋亡抑制蛋白靶向剂LCL161和YM155对食管癌放射敏感性的影响及机制研究

发布时间：2018-05-01 04:27

本文选题：放射治疗 + LCL161　；参考：《南京医科大学》2015年博士论文

【摘要】：第一部分:SMAC模拟物LCL161对食管癌细胞放射敏感性的影响及机制研究目的:观察新型SMAC小分子模拟物LCL161对食管癌细胞IAP蛋白家族表达的抑制情况,并在体外检测LCL161对多个食管癌细胞株放射敏感性的影响,并探讨LCL161增加食管癌细胞放射敏感性的分子机制。方法:选用3种食管鳞癌细胞株Eca109、TE13、KYSE150进行研究,梯度浓度LCL161处理细胞后,采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)观察LCL161对食管癌细胞增殖能力的影响。分别给予LCL161单药、6MV X线单纯照射或LCL161联合X线照射处理后,平板克隆形成实验观察LCL161(5μmol/L)对食管癌放射敏感性的影响;Annexin V-PI双染色后采用流式细胞术检测各组细胞凋亡率;采用免疫荧光技术观察照射前后不同时间点细胞磷酸化γH2AX焦点数量,评价DSBs修复动力学改变;应用蛋白免疫印迹法(Western-blot)测定LCL161处理后细胞XIAP、c-IAP1、c-IAP2表达变化,并检测各处理组凋亡相关蛋白水平;反转录PCR法和ELISA法分别检测受照细胞合成和分泌的TNFα水平。结果:LCL161单药处理对食管癌细胞没有明显增殖抑制作用,其作用于Eca109、TE13细胞株半抑制率浓度IC50值均大于200μmol/L。克隆形成实验表明,与对照组相比加用5μmol/L LCL161可显著降低3种食管癌细胞照射后的集落形成能力,其对三种细胞株的放射增敏比SER分别为1.42、2.0、1.64。γH2AX焦点分析表明LCL161显著增加放射诱导的DNA双链断裂,并抑制肿瘤细胞DSBs修复能力。LCL161使放射线导致的食管癌细胞凋亡率明显增加,且在TE13、KYSE150细胞中,联合治疗组与单纯放射组的差异具有统计学意义(P0.05)。但LCL161没有增加正常细胞NIH3T3受照射后的凋亡水平。LCL161对肿瘤细胞的促凋亡作用可以被泛caspases抑制剂z-VAD-FMK所阻断。与NIH3T3相比,三种食管癌细胞株均呈现IAP蛋白家族过表达,LCL161显著抑制食管癌细胞c-IAP1蛋白表达水平,此效应呈现浓度依赖性,而对其他IAP蛋白的表达没有明显影响。此外LCL161联合放射处理的Eca109细胞活化caspase-8表达量显著高于单纯放射处理组,同时TNFα的表达和分泌量也显著增加,两组间差异具有统计学意义(P0.05)。结论:食管癌细胞株较正常细胞过表达XIAP、c-IAP1、c-IAP2,LCL161可能是通过抑制c-IAP1表达,增加放射诱导的细胞caspase-8活化以及TNFα合成分泌,从而依赖死亡受体通路促进食管癌细胞凋亡,发挥放射增敏作用。但LCL161并不增加正常组织细胞对放射线的敏感性,因而是具有临床应用前景的肿瘤靶向放射增敏剂。第二部分:Survivin抑制剂YM155去除G_2期阻滞提高食管癌放射敏感性的研究目的:Survivin在多种肿瘤细胞中过表达并通过调节细胞增殖、凋亡增加肿瘤细胞放化疗抵抗,YM155是survivin的小分子抑制剂,可增强多种抗肿瘤药物的细胞毒性。本课题通过体内移植瘤和体外细胞实验观察YM155对食管癌放射敏感性的影响,并探讨其通过调节细胞周期、DNA双链断裂修复等发挥放射增敏作用的分子机制。方法:采用MTT实验检测YM155单药对食管癌细胞Eca109、TE13的增殖抑制作用;平板克隆形成实验观察YM155对这两种细胞放射敏感性的影响;流式细胞术检测单纯放射治疗、单纯加药、YM155与放射联合对细胞周期分布的影响;免疫荧光染色检测细胞核磷酸化γH2AX(绿色)、RAD51(红色)焦点数量,以评价放射治疗后细胞DNA双链断裂和修复动力学变化;蛋白印迹法(Western-blot)测定在YM155通过影响细胞周期进程增加食管癌放射敏感性过程中,细胞内Cdc2 Thr14/Tyr15磷酸化水平及cyclin B1等周期调节蛋白的表达变化。建立BALB/c裸鼠食管癌移植瘤模型,将24只裸鼠随机分为四组分别给予生理盐水、单药YM155、单纯放射治疗、YM155联合放射处理,观察比较各组肿瘤生长、裸鼠体重差异,切取肿瘤组织切片免疫组化检测survivin、cleaved caspase-3,TUNEL染色法行组织细胞凋亡原位检测。结果:YM155可显著增加食管癌细胞的放射敏感性,10nmol/L YM155对Eca109、TE13细胞的放射增敏比SER分别为1.51和1.73。细胞周期分析表明:X线照射可明显导致两种细胞G_2期阻滞,Eca109细胞照射前后的G_2期细胞比例分别为28.0%、62.5%,TE13细胞分别为23.9%、66.8%;YM155可显著消除放射线导致的细胞G_2期阻滞,YM155联合放射处理后Eca109细胞的G_2期比例下降为34.7%,TE13为36.4%。YM155对G_2期细胞阻滞的消除作用与其降低照射后细胞内磷酸化Cdc2 Thr14/Tyr15含量,激活Cdc2-cyclin B1复合物激酶活性有关。免疫荧光染色表明Eca109细胞受照射后30min内胞核染色体发生显著双链断裂(DSBs),表现为绿色γH2AX荧光焦点,随后绿色焦点随时间延长而逐渐减少,同时红色RAD51焦点数量逐渐增加,表明DSBs被细胞逐渐修复。而YM155+照射组在照射后的各个时间点的绿色焦点数目均显著多于单纯照射组,红色焦点数目则显著少于单纯照射组(P0.05)。说明YM155抑制食管癌细胞对放射性DSBs的修复。裸鼠移植瘤研究表明,与对照组相比,单纯加药组、单纯放射组和YM155联合放射治疗组的裸鼠移植瘤生长均有所延缓,各组肿瘤倍增时间分别为5.7±0.5天、9.0±1.6天、8.0±2.0天、17.6±6.5天,以联合治疗组的肿瘤生长延缓最为显著,平均达11.9天。由此计算出YM155的放射增强因子(EF)为3.75。裸鼠移植瘤切片免疫组化检测表明YM155单药或与放射治疗联合使肿瘤组织的survivin表达强度明显下降,三种治疗组的caspase-3裂解片段量及TUNEL染色强度均较对照组增加,且以联合治疗组最为显著(P0.01)。结论:对于人食管癌细胞系Eca109和TE13,YM155能够消除放射导致的G_2期细胞停滞,其机制可能与抑制Cdc2 Thr14/Tyr15磷酸化、激活Cdc2的激酶活性有关。通过去除G_2期阻滞,YM155减弱肿瘤细胞修复放射性DNA双链损伤的能力,从而增加细胞对放射线的敏感性。
[Abstract]:The effects of LCL161 ( 5 渭mol / L ) on the radiosensitivity of esophageal cancer cells were investigated by MTT assay . The results showed that YM155 inhibited the cell arrest of esophageal cancer cells after irradiation . The results showed that the expression intensity of the cells of Eca109 cells was significantly lower than that in the control group .

【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.1

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